信號肽對溶血素在大腸桿菌中跨膜轉(zhuǎn)運的影響

齊安生，張秀娟，宮楓舉，張興進，馬 喆，潘子豪，孫學強，

（1. 黑龍江省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江哈爾濱 150069；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；4. 南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇南京 210095）

1971年洛克菲勒大學細胞生物學教授Blobel提出了“信號假說”（Signal hypothesis），用以解釋生理狀態(tài)下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的去向問題。隨后該假說得到了證實并具有普遍意義，他因此獲得了1999年諾貝爾生理學醫(yī)學獎?！靶盘柤僬f”認為蛋白質(zhì)的合成在核糖體上進行。信號肽（Signal peptide）是蛋白質(zhì)的一個片段，能夠引導核糖體并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并將不斷合成的肽鏈穿過通道，隨后信號肽被切割下來，完整的蛋白被釋放進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后被轉(zhuǎn)運到胞外[1]。研究發(fā)現(xiàn)，一般情況下，新生蛋白通常在位于其N端信號肽的指引下到達細胞特定區(qū)域，并由其介導完成跨膜轉(zhuǎn)運[2]。

豬鏈球菌屬于鏈球菌屬，現(xiàn)在公認的血清型有33個， 其 中2型（Streptococcus suis type 2，SS2）最為常見，也最重要[3]。大多數(shù)SS2分離株都能產(chǎn)生溶血素并分泌至細胞外。豬鏈球菌溶血素（Suilysin，SLY）屬巰基活化的溶細胞素家族（TACY）溶血素[4]，為單鏈多肽，N端70個殘基（1/8的分子量）可以被除去而不影響其溶紅細胞活性。通過對其基因序列的分析發(fā)現(xiàn)5′端約81 bp編碼的27個氨基酸殘基為信號肽序列。該序列與SLY結(jié)構(gòu)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)。

本試驗以溶血素基因為主要研究對象，探索了信號肽對溶血素在大腸桿菌中跨膜轉(zhuǎn)運的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株、抗體、酶等

豬鏈球菌2型HA9801株、pET28a（+）質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和Rosetta株：由本實驗室保存；豬鏈球菌2型溶血素單克隆抗體：由華中農(nóng)業(yè)大學金梅林教授饋贈；Taq酶、限制酶：購自寶生物（大連）工程有限公司；引物：由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；硝酸纖維素膜及電泳試劑等：Sigma公司產(chǎn)品；核酸膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、HRP-SPA、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 基因克隆、合成及表達載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布序列DQ443530和生物信息學分析設計合成3條引物：

S1-F：GGAGCCATGGGAAAAAGTTCGCACTTGATT；

S2-F：GCTGCCATGGATTCCAAACAAGATATTAATCAGTA；

S-R：CGCAGGATCCTTACTCTATCACCTCATCCGCATAC

以豬鏈球菌2型HA9801株基因組為模板，分別以S1-F和S-R、 S2-F和S-R為引物對，經(jīng)53 ℃退火、72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，擴增得到帶有信號肽的溶血素基因sly1和擴增不帶有信號肽的溶血素基因sly2；將sly1和sly2雙酶切后分別定向克隆至原核表達載體pET28a（+），構(gòu)建原核表達載體pET28a/sly1和pET28a/sly2（圖1）。

圖1 pET28a/sly1和pET28a/sly2質(zhì)粒圖譜

pET28a/sly1和pET28a/sly2轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞并在含有卡那霉素的LB瓊脂平板進行篩選。經(jīng)PCR、酶切和測序分析鑒定正確后，分別選1株陽性克隆轉(zhuǎn)化Rosetta表達宿主菌，并在卡那氯霉素雙抗性平板進行篩選。

1.3 溶血素的誘導表達

重組表達載體pET28a/sly1和pET28a/sly2轉(zhuǎn)化Rosetta后，各挑選1株，分別命名為Rsly1和Rsly2，接種含有卡那氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，振蕩過夜后，按照2%體積接種50 mL含有卡那氯霉素雙抗性LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)4 h后，加入IPTG誘導3 h，然后12 000 r/min 4 ℃離心5 min，分別收集上清和菌體。設立未加IPTG進行誘導的對照，并同步同方法處理。

對Rsly1和Rsly2的誘導培養(yǎng)物離心上清，用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，取3 mL加入終濃度為10%的三氯醋酸（TCA）冰浴30 min，然后10 000 g 4 ℃離心15 min，棄上清，加入500 μL冷丙酮洗滌，10 000 g 4 ℃離心15 min，去掉上清，風干5 min，然后加入32 μL 1×PBS充分溶解，沉淀后分別命名為rSLY1′和rSLY2′。將Rsly1和Rsly2的誘導培養(yǎng)菌體用1×PBS洗滌2次，最后用20 mL充分懸浮，取樣后超聲波破碎，12 000 g 4 ℃離心20 min，取上清用0.22 μm的微孔濾膜過濾，分別命名為rSLY1和rSLY2。未進行誘導的Rsly1和Rsly2對照同步同方法處理。

1.4 天然野生型SLY的提取

參照陳國強[5]等方法，將過夜培養(yǎng)的豬鏈球菌2型HA9801株種子液，按照2%體積接種5L THB液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)約12 h后，離心收集上清，加入硫酸銨至終濃度達到50%飽和度，離心收集沉淀，用40 mL 20 mmol/L的Tris-HCl重懸沉淀，經(jīng)過透析脫鹽后，超濾濃縮為8 mL，分裝?20 ℃凍存，命名為SLY。

1.5 重組溶血素的溶血活性試驗

將rSLY1和rSLY2用Thermo NanoDrop 2000測定總蛋白含量。參照Gottschalk等方法[12]，各取0.5 mL加入2.5 mol/L的二硫代蘇糖醇（DTT）至終濃度為5 mmol/L，室溫孵育30 min后，分別用0.5 mL PBS進行倍比稀釋；加入0.5 mL 2%（V/V）的兔血紅細胞，同時設0.5 mL超純水陽性對照和PBS陰性對照；顛倒混勻后，37 ℃靜置孵育1 h，然后6 000 g 離心5 min；分別取各樣本200 μL上清，用分光光度計測定A540。在PBS陰性對照不溶血，即A540約為0的條件下，以吸光值達到超純水陽性對照的50%為1個溶血活性單位，計算各樣本的溶血活性單位。

1.6 固體培養(yǎng)的信號肽功能試驗

將Rsly1和Rsly2移植至含有IPTG的卡那霉素氯霉素的8%綿羊血的瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察溶血結(jié)果。

1.7 液體培養(yǎng)的信號肽功能試驗

按照常規(guī)方法制備5%的濃縮膠和12%分離膠；將樣本 SLY、rSLY1′、rSLY2′、rSLY1、rSLY2，分別按比例加入5×SDS-PAGE載樣緩沖液后煮沸6 min，10 000 r/min 4 ℃離心5 min，然后取各上樣10 μL進行電泳。

采用半干法轉(zhuǎn)印至NC膜后，用5%的脫脂奶封閉過夜；將轉(zhuǎn)印膜在含20 μL SLY單抗的20 mL TBST中，37 ℃孵育1 h；然后用TBST洗滌2次，每次10 min；20 mL TBST+20 HRP-SPA 37 ℃作用1 h后，用TBST洗滌2次；用DAB顯色約30 s后終止反應，晾干觀察。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆及表達載體的構(gòu)建

以豬鏈球菌2型HA9801株基因組為模板，擴增獲得帶有信號肽序列的sly1（長度約為1 500 bp）和不帶有信號肽序列的sly2（長度約為1 400 bp）的豬鏈球菌2型溶血素基因。構(gòu)建的pET28a/sly1和pET28a/sly2，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定均正確。

圖2 Rsly1和Rsly2固體培養(yǎng)溶血活性

2.2 重組溶血素的溶血活性試驗

用Thermo NanoDrop 2000測定制備的rSLY1和rSLY2的總蛋白含量分別為6.2和7.1 mg/mL。參照Gottschalk等方法，測定提取的HA9801天然野生型SLY溶血活性單位含量為212，rSLY1為212，rSLY2 為 214。

2.3 固體培養(yǎng)的信號肽功能試驗

在含有IPTG的卡那霉素氯霉素的8%綿羊血的瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)Rsly1菌落周圍出現(xiàn)2～4 mm溶血環(huán)，Rsly2菌落周圍未見溶血環(huán)，證明重組溶血素在大腸桿菌中表達時，信號肽能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)運至細胞外并發(fā)生溶血現(xiàn)象。

2.4 液體培養(yǎng)的信號肽功能試驗

分別對Rsly1和Rsly2的誘導和同步未誘導培養(yǎng)物的上清和菌體處理后，進行SDS-PAGE和免疫印跡試驗，發(fā)現(xiàn)所有未誘導的上清和菌體中均沒有與SLY單抗雜交的條帶出現(xiàn)（圖3-A和圖3-B的1、5、3、7泳道）；Rsly1和Rsly2誘導后的菌體樣本均出現(xiàn)以56 kD為主的現(xiàn)梯形條帶（圖3-B的4、8泳道）；Rsly1誘導培養(yǎng)物上清（圖3-B的2泳道）與野生型SLY（圖3-B的9泳道）的分子量一致，出現(xiàn)約56 kD的雜交條帶；而Rsly2誘導培養(yǎng)物上清（圖3-B的6泳道）未出現(xiàn)任何雜交條帶。試驗證明了在液體培養(yǎng)中，信號肽能夠引導表達的重組溶血素蛋白跨膜轉(zhuǎn)運到細胞外，而且Rsly1誘導培養(yǎng)物上清上清中的重組溶血素分子量與HA9801溶血素分子量一致，說明重組蛋白轉(zhuǎn)運到細胞外后其N端的信號肽已被剪切掉；同時不帶有信號肽的重組蛋白不能完成跨膜轉(zhuǎn)運。

圖3 Rsly1和Rsly2誘導菌體和上清中重組溶血素SDS-PAGE和Western-Blot

3 討論

SS2已經(jīng)成為危害養(yǎng)豬生產(chǎn)及人類健康的重要人獸共患病病原[6]。其耐藥性日益增強，因而免疫預防依然是防制豬鏈球菌病的重要措施。SS2毒力基因以及保護性抗原的研究報道日漸增多，莢膜多糖（CPS）、溶血素、MRP和EF等是其重要毒力因子已經(jīng)得到共識。

溶血素作為SS2分泌到細胞外的一種重要的外毒素，具有良好的免疫原性，相對與其他毒力因子屬于分泌型，因此也成為構(gòu)建弱毒株研究的主要缺失靶標。倪艷秀[7]、王雅等[8]、吳煒等[9]分別報道了SS2溶血素缺失株的構(gòu)建，認為其可引起毒力下降和對不同動物致病性的下降；在諸多有關(guān)SS2溶血素的缺失株構(gòu)建和基因表達等研究報道中，有關(guān)其信號肽的報道較少，大多數(shù)研究以其結(jié)構(gòu)基因及功能為主。本試驗構(gòu)建了信號肽缺失的溶血素表達載體，證實了缺失信號肽的重組溶血素不能在大腸桿菌細胞中跨膜轉(zhuǎn)運，從而為構(gòu)建SS2溶血素缺失弱毒株提供一種新的基因缺失設計思路。

信號肽在引導外源蛋白分泌過程中具有重要作用，而且沒有嚴格專一性，因而可利用信號序列分泌外源蛋白。目前研究采用的信號肽可分為自身信號肽和外源信號肽，常用的有大腸桿菌的外膜蛋白，如外膜蛋白OmpA 、OmpF、λ噬菌體受體LamB、熱穩(wěn)定腸毒素STⅡ等。研究表明，多種外源基因連接上信號肽后，在原核表達系統(tǒng)，如大腸桿菌、L型細菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌中等，都得到了分泌表達[10]。外源蛋白在宿主菌如大腸桿菌中的表達形式多為細胞內(nèi)包涵體不溶性表達，少數(shù)為細胞外分泌表達。利用信號肽來引導外源蛋白定位分泌到細胞特定區(qū)間，可提高可溶性，避免因包涵體復性帶來的困難。在菌株、培養(yǎng)和發(fā)酵等逐漸成熟的條件下，構(gòu)建高效的表達載體以提高外源蛋白質(zhì)的表達量是降低工業(yè)化生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)信號肽對蛋白質(zhì)的定位有著非常重要的作用，使得信號肽的研究不僅具有重要的理論意義，而且也具有潛在的應用價值[11]?；谛盘栯牡墓δ軐χ亟M抗體分泌同樣具有重要作用，通過添加一段合適的信號肽序列來引導重組抗體的分泌，不僅可以提高分泌效率和簡化下游的純化過程，而且對抗體的穩(wěn)定性和活性都有積極作用，當然信號肽序列的選擇和優(yōu)化要根據(jù)不同的蛋白質(zhì)及表達系統(tǒng)來進行[12]。

在本試驗中，以溶血素為研究對象，所構(gòu)建的重組表達載體能夠在大腸桿菌中進行可溶性表達，重組蛋白非包涵體形式，溶血素信號肽能夠介導跨膜轉(zhuǎn)運，但是跨膜轉(zhuǎn)運至大腸桿菌細胞外重組蛋白少于細胞內(nèi)積累的重組蛋白，轉(zhuǎn)運效率相對不高。從Western-Blot圖譜上，絕大多數(shù)的重組蛋白在宿主細胞內(nèi)積累，但是根據(jù)誘導后的菌體處理方法可見并未形成包涵體，因此可進一步優(yōu)化表達條件，如調(diào)節(jié)IPTG的濃度、誘導溫度、延長誘導時間等，在降低表達效率同時提高重組蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運。當然溶血素信號肽的N端多肽結(jié)構(gòu)域、疏水活性以及信號肽轉(zhuǎn)運后的剪切機制還有待于進一步的分析和研究；溶血素信號肽能否提高包涵體形式表達的外源蛋白可溶性、能否引導包涵體形式的外源蛋白進行跨膜轉(zhuǎn)運、能否引導外源蛋白在真核宿主細胞內(nèi)實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運，也有待于進一步研究。

4 結(jié)論

本試驗以溶血素基因為主要研究對象，通過基因克隆構(gòu)建了帶有和不帶有信號肽序列的重組溶血素表達載體，將篩選的大腸桿菌陽性克隆，在固體和液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以固體培養(yǎng)溶血現(xiàn)象的發(fā)生以及液體培養(yǎng)物的Western-Blot，證明缺失了信號肽的重組溶血素不能被跨膜轉(zhuǎn)運至細胞外；同時帶有溶血素信號肽的重組溶血素能夠跨膜轉(zhuǎn)運大腸桿菌細胞外。本試驗為豬鏈球菌2型基因缺失弱毒疫苗的研究、細菌信號肽以及基因工程重組蛋白的可溶性表達進行了有益探索。

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