云貴川三省部分地區(qū)警犬狂犬病血清中和抗體調(diào)查

杜曉鵬，劉婷芳，徐 陶，王宇洋，毛愛國，許煒迪，張 垚，王 雄，黨西鋒，張明飛，馮 燁

（1. 公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；3. 四川省公安廳警犬基地，四川成都 610041；4. 貴州省公安廳警犬基地，貴州貴陽 550000）

狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（RABV）感染引起的一種致死性人獸共患病，病死率幾乎高達(dá)100%[1]。目前，對狂犬病尚無有效治療方法，及時(shí)接種疫苗是預(yù)防狂犬病最有效措施之一[2]。犬狂犬病免疫覆蓋率低于70%是誘發(fā)人間狂犬病發(fā)生的主要原因[3]。2016年全國共報(bào)告644例人狂犬病死亡病例。盡管狂犬病疫情整體呈下降趨勢，但貴州、四川、云南等省份仍是我國人和動(dòng)物狂犬病高發(fā)地區(qū)[4]。

為了解我國警犬狂犬病免疫效果，分析影響警犬免疫合格率的因素，便于制定合適的警犬免疫程序，提高免疫合格率，于2017年對云南、貴州、四川三省部分地區(qū)警犬開展了狂犬病免疫血清中和抗體監(jiān)測。

1 監(jiān)測對象

1.1 范圍

選取云南省昆明市、貴州省貴陽市，以及四川省成都、綿陽、德陽、瀘州市等6個(gè)訓(xùn)練場3月齡以上、臨床檢查健康的警犬進(jìn)行抽樣調(diào)查，包括幼犬、訓(xùn)練犬、種犬等。

1.2 背景

1.2.1免疫程序 6個(gè)地區(qū)的警犬免疫程序相同：3月齡時(shí)進(jìn)行第1次狂犬病滅活疫苗注射；1歲以后，每年春季進(jìn)行1次狂犬病滅活疫苗注射。幼犬在6月齡左右進(jìn)行科目訓(xùn)練，訓(xùn)練3～6個(gè)月調(diào)至新工作單位后，其免疫程序并入新單位的年度免疫。

1.2.2疫苗種類 云南省、貴州省選用的是A品牌的犬、貓狂犬病滅活疫苗（Pasteur RIV株，至少2 IU），定義為A組；四川省選用的是B品牌的狂犬病滅活疫苗（HCP-SAD株，滅活前不少于106.3FAID50/mL），定義為B組。

1.2.3犬種 檢測的犬種包括德國牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬、羅威納犬、拉布拉多犬、史賓格犬與邊境牧羊犬。按照中國工作犬管理協(xié)會(huì)（CWDMA）的犬種分組表[5]，將檢測犬分為大型犬（身高55 cm以上）、中型犬（身高35.1～54.9 cm）與小型犬（身高35 cm以下）。其中，德國牧羊犬、馬里努阿犬、昆明犬與羅威納犬屬于大型犬，拉布拉多犬、史賓格犬與邊境牧羊犬屬于中型犬。此次監(jiān)測沒有小型犬。

2 抽樣方法與數(shù)量

根據(jù)云南、貴州、四川三省的警犬工作布局情況，選取6個(gè)對周邊工作具有輻射性、警犬?dāng)?shù)量相對多的單位進(jìn)行抽樣。先將每個(gè)抽樣單位的犬群以年齡為單位進(jìn)行分類，即：3～6月齡、7～12月齡和1歲以上3個(gè)年齡段，再按下述方法進(jìn)行抽樣：

3～6月齡，每窩犬、每個(gè)性別，按照10%的比例進(jìn)行間隔抽樣；7～12月齡，每個(gè)單位、每個(gè)月齡段、每個(gè)性別，按照10%的比例進(jìn)行間隔抽樣；1歲以上，每個(gè)單位以每12個(gè)月為選擇時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段、每個(gè)性別，按照10%的比例進(jìn)行間隔抽樣。當(dāng)每組的警犬總數(shù)不超過20只時(shí)，間隔抽樣可以進(jìn)行；超過20只時(shí)，按照“隔2抽1”或“隔3抽1”原則抽樣，以此類推。

根據(jù)上述原則，在云南省昆明市某訓(xùn)練場選取56只警犬，在貴州省貴陽市某訓(xùn)練場選取60只警犬，在四川省成都市、綿陽市、德陽市、瀘州市4個(gè)訓(xùn)練場選取71只警犬，共187只。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測

3.1 材料

3.1.1檢測試劑 標(biāo)準(zhǔn)血清：購自法國歐盟狂犬病血清學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室，效價(jià)為5.92 IU/mL；陰性血清：采集自未免疫健康犬，由軍事獸醫(yī)研究所的世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）狂犬病參考實(shí)驗(yàn)制備；FITC熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體：購自Fujiribio公司；狂犬病病毒CVS-11細(xì)胞毒：軍事獸醫(yī)研究所保存，滴度為106.67TCID50/mL。

3.1.2待檢血清 從待檢犬前肢頭靜脈采血至少3 mL，靜置2 h，1 500 r/min離心30 min，分離血清，冷凍保存或冷鏈運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，備用。如出現(xiàn)溶血，需重新采集血樣并分離血清。

3.2 方法

3.2.1樣本處理 將待檢血清56 ℃滅活30 min。

3.2.2檢測 采用OIE《陸生動(dòng)物診斷測試和免疫手冊》（2013版）[6]中規(guī)定的直接免疫熒光病毒中和試驗(yàn)（FAVN），對待檢血清進(jìn)行RABV中和抗體效價(jià)檢測。首先對標(biāo)準(zhǔn)血清和待檢血清進(jìn)行3倍梯度稀釋，稀釋區(qū)域第1列各孔內(nèi)預(yù)先加入100μL培養(yǎng)液，每孔加入血清50 μL，混勻后吸取50μL加入第2列，依次稀釋。取預(yù)先確定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培養(yǎng)液將其稀釋至30～300 TCID50/50 μL，除細(xì)胞及培養(yǎng)液對照孔外，每孔加入病毒稀釋液50 μL，置37 ℃中和1 h。BHK-21細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、分散、計(jì)數(shù)后，稀釋至4×105/mL，除培養(yǎng)液對照孔外，每孔加入50 μL細(xì)胞懸液，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入50 μL冷丙酮，?20 ℃固定細(xì)胞1 h；PBST洗滌后，將RABV核蛋白熒光抗體稀釋至工作濃度，每孔加入50 μL工作液，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，熒光顯微鏡下觀察每個(gè)孔?？變?nèi)有熒光細(xì)胞即為感染，為陽性；無熒光細(xì)胞為完全中和，為陰性。利用基于Spearman-Karber推導(dǎo)的公式計(jì)算待檢血清的病毒中和效價(jià)。以犬免疫后的血清中和抗體效價(jià)≥0.50 IU/mL為陽性標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到或超過0.50 IU/mL即具有效保護(hù)水平。

3.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 檢測數(shù)據(jù)采用SPSS18.0及Excel 2007進(jìn)行分析處理。

4 結(jié)果與分析

4.1 總體情況

采集187只警犬血清進(jìn)行RABV中和抗體效價(jià)檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性127只，整體免疫合格率為67.91%（表1）。其中，四川省的警犬免疫合格率高于云南省，兩者之間差異顯著（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；貴州與云南、貴州與四川之間差異不顯著（P＞0.05），不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 187只警犬RABV中和抗體檢效價(jià)檢測結(jié)果

4.2 不同年齡警犬檢測

對187只警犬，按照年齡進(jìn)行分類檢測發(fā)現(xiàn)，6歲以上警犬的抗體合格率最高，為87.10%，7～12月齡警犬最低，為41.67%。具體見表2。

4.3 不同免疫次數(shù)警犬檢測

對187只警犬，按照免疫次數(shù)進(jìn)行分組檢測，發(fā)現(xiàn)免疫4次及以上的合格率最高，為86.79%，免疫1次的最低，僅為53.4%；免疫2次以上警犬的合格率明顯高于免疫1次的警犬（P＜0.01）。具體數(shù)據(jù)見表3。

表2 不同年齡的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果

表3 不同免疫次數(shù)警犬的RABV中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果

4.4 不同疫苗免疫警犬檢測

在選用A品牌疫苗免疫的警犬中，檢出陽性73份，免疫合格率為62.93%；而選用B品牌疫苗免疫警犬的合格率為76.06%，差異顯著（P＜0.05）。具體見表4。

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果

4.5 不同體型警犬檢測

對187只警犬，按照體型大小進(jìn)行分類檢測發(fā)現(xiàn)，中型犬的免疫合格率為65.52%，大型犬為68.35%（表5），兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說明警犬的體型大小對狂犬病免疫合格率影響不大。

表5 不同體型的警犬RABV中和抗體效價(jià)檢測結(jié)果

4.6 不同性別警犬檢測

對187只警犬，按性別進(jìn)行分類檢測。結(jié)果顯示，公犬的免疫合格率為67.39%，母犬為68.42%（表6），兩者之間差異不顯著（P＞0.05），說明性別對狂犬病免疫合格率影響不大。

表6 不同性別的警犬RABV中和效價(jià)檢測結(jié)果

5 討論

本次檢測的警犬狂犬病總體免疫合格率為67.91%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）研究表明，狂犬病抗體合格率大于70%，即可有效防控狂犬病傳播[7]。本次檢測發(fā)現(xiàn)警犬的免疫抗體合格率尚沒有達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)，表明部分警犬的狂犬病免疫效果并不理想。為尋找影響警犬狂犬病免疫效果的因素，本研究分析了不同年齡、不同免疫次數(shù)、不同疫苗類型，以及不同體型和性別的檢測結(jié)果。研究數(shù)據(jù)表明，警犬狂犬病免疫合格率與犬的年齡、免疫次數(shù)、疫苗類型等因素有一定的關(guān)系，而與體型和性別關(guān)系不大。

檢測發(fā)現(xiàn)1歲以下幼犬的免疫合格率為41.67～56.14%，而1歲以上警犬的免疫合格率均超過70%。這與Kennedy等[8]的研究結(jié)果相同。這是因?yàn)槟挲g較小的犬免疫系統(tǒng)不健全，接種疫苗的效果較差。本研究發(fā)現(xiàn)7～12月齡警犬的免疫合格率低于3～6月齡。這可能與其訓(xùn)練時(shí)間和調(diào)動(dòng)有關(guān)。據(jù)調(diào)查，警犬從6月齡開始進(jìn)行訓(xùn)練，3～6個(gè)月完成訓(xùn)練科目后，被調(diào)往新的工作單位，參加新單位的年度狂犬病疫苗免疫。在此過程中便形成了免疫空檔期。因此，為了提高免疫合格率，除對6月齡以下的警犬增加免疫次數(shù)外，對于7～12月齡警犬，在離開原訓(xùn)練場前或者調(diào)入新單位后應(yīng)立即注射狂犬病疫苗，以消除免疫空檔期。

本研究結(jié)果顯示，警犬性別、體型對狂犬病免疫合格率影響不大。但有研究表明，中大型純種犬免疫效果不如小型犬或雜交犬[8-9]，因此可以通過增加免疫次數(shù)來提升中大型警犬的抗體水平。在本研究中，免疫2～3次、免疫4次及以上警犬的免疫合格率均明顯高于免疫1次的警犬，說明免疫合格率與免疫次數(shù)密切相關(guān)，免疫次數(shù)越多，合格率越高。

本次檢測發(fā)現(xiàn)，四川省采用的B疫苗免疫效果高于云南、貴州兩省的A疫苗，說明不同類型疫苗對警犬的免疫合格率也有影響。

以上檢測結(jié)果雖然反映出警犬的狂犬病免疫合格率與犬的年齡、免疫次數(shù)、疫苗類型等因素有關(guān)，且不受警犬性別和體型大小影響。但本次調(diào)查僅為橫斷面調(diào)查，如果對每一個(gè)影響因素進(jìn)行連續(xù)性分析，結(jié)果是否與上述相同，就需后續(xù)研究證明。

6 結(jié)論與建議

本調(diào)查抽檢云南昆明市、貴州貴陽市，以及四川成都市、綿陽市、德陽市、瀘州市，共6個(gè)訓(xùn)練場的187只警犬進(jìn)行狂犬病免疫抗體檢測，發(fā)現(xiàn)總體免疫合格率為67.91%，未達(dá)到70%的國際標(biāo)準(zhǔn)。這主要是因?yàn)?歲以下幼犬的免疫合格率普遍較低，為41.67～56.14%。研究發(fā)現(xiàn)免疫次數(shù)越高，抗體合格率越高。另外，不同疫苗種類也對免疫效果有影響。

因此應(yīng)加強(qiáng)對1歲以下幼犬的免疫，對6月齡以下警犬進(jìn)行2次狂犬病滅活疫苗免疫，即3月齡時(shí)進(jìn)行第1次基礎(chǔ)免疫，間隔28 d后進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫；對7～12月齡警犬，在離開原訓(xùn)練場前或進(jìn)入新單位后，隨即進(jìn)行1次狂犬病疫苗免疫，以消除免疫空檔期。對1歲以上警犬，應(yīng)繼續(xù)執(zhí)行每年1次的疫苗免疫程序，并提高血清中和抗體監(jiān)測力度，對不合格警犬及時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

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