蕓薹屬蔬菜遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新研究進(jìn)展

支 肖 曹麗雯 于寧寧 齊振宇 陳利萍

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310058）

蕓薹屬（Brassica）植物包括白菜類、芥菜類以及甘藍(lán)類蔬菜，具有種類繁多、遺傳資源豐富、產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、栽培面積廣、生長周期短等特點(diǎn)（Struss et al.，1991；Mei et al.，2011；Geng et al.，2013）。由于長期的人工選擇和優(yōu)良品種的大面積栽培，以及人們對蔬菜種類和品質(zhì)要求的不斷提高，現(xiàn)有的和可利用的親本資源已具有一定的局限性。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段創(chuàng)制出優(yōu)質(zhì)、抗病、高產(chǎn)的新種質(zhì)資源，是當(dāng)前蔬菜產(chǎn)業(yè)亟待解決的重要問題之一。本文從遠(yuǎn)緣雜交、種間嫁接、體細(xì)胞雜交、分子育種等方面綜述了蕓薹屬蔬菜在遺傳改良及種質(zhì)創(chuàng)新研究上的新進(jìn)展，以期為蕓薹屬蔬菜新品種的選育提供理論依據(jù)和新途徑。

1 遠(yuǎn)緣雜交

遠(yuǎn)緣雜交（distant hybridization）是指親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種屬間或物種間的雜交，它可以使優(yōu)良性狀的基因在種、屬之間通過有性雜交的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移。自1917年Kajanus將甘藍(lán)型油菜與蕪菁通過有性雜交的方法獲得了種間雜種以來，遠(yuǎn)緣雜交被廣泛應(yīng)用到蕓薹屬蔬菜育種中（Kajanus，1917）（表1）。例如，Sharma等（2017）將花椰菜Pusa Sharad（B. oleracea，CC）與抗黑腐病的埃塞俄比亞芥NPC-9（B. carinata，BBCC）雜交加倍，獲得的F1（BCC）具有黑腐病抗性，繼而通過將F1與花椰菜回交使黑腐病抗性漸滲入回交第1代植株，實(shí)現(xiàn)了埃塞俄比亞芥的抗黑腐病優(yōu)良基因向花椰菜的轉(zhuǎn)移。再如，十字花科植物中的多種類型的雄性不育源，Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）、Polima CMS等通過甘藍(lán)型油菜被轉(zhuǎn)移到大白菜或蕪菁中（柯桂蘭 等，1992；姚祥坦 等，2004），其中甘藍(lán)型油菜中的Ogura CMS是通過蘿卜轉(zhuǎn)育而來。遠(yuǎn)緣雜交后全套異源染色體組導(dǎo)致的遺傳學(xué)上的不穩(wěn)定性是遠(yuǎn)緣雜種生產(chǎn)應(yīng)用的最大問題。為了解決遠(yuǎn)緣雜種的不穩(wěn)定性，育種家們在遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)上創(chuàng)建了異附加系（alien addition line）。異附加系是指通過雜交或其他方法在原有染色體組中附加1條或者1條以上異源種屬的染色體。異附加系不但實(shí)現(xiàn)了外源優(yōu)異基因的轉(zhuǎn)移，還避免了其他異源染色體上不良基因的影響。例如，劉煒等（2008）通過遠(yuǎn)緣雜交獲得大白菜—甘藍(lán)異源三倍體（AAC）后，與二倍體大白菜（B. rapa，AA）回交，從中分別篩選出大白菜—甘藍(lán)7號和9號單體附加系，為進(jìn)一步獲得大白菜和結(jié)球甘藍(lán)易位系、代換系提供了基礎(chǔ)材料。

表1 遠(yuǎn)緣雜交在蕓薹屬蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用

在遠(yuǎn)緣雜交過程中，異源基因組的相互作用導(dǎo)致大量遺傳與表觀遺傳變異，使雜種后代在生物量、適應(yīng)性等方面表現(xiàn)出超親性狀，形成雜種優(yōu)勢。Ghani等（2014a，2014b）通過大白菜與黑芥的遠(yuǎn)緣雜交及其染色體加倍，觀察到異源四倍體雜種后代AABB與雙親（AA和BB）相比，表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢。通過small RNA高通量測序，發(fā)現(xiàn)與親本相比，AABB的miRNAs總體表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢，miRNA表達(dá)水平的改變引起了表型相關(guān)基因的改變，該研究結(jié)果證明了small RNA水平的改變與遠(yuǎn)緣雜交中基因表達(dá)水平改變及超親性狀的產(chǎn)生具有相關(guān)性。這一研究結(jié)果為蔬菜遺傳改良與新品種選育提供新的理論依據(jù)。

Li等（2015）以莖瘤芥（B. juncea，AABB）和紫甘藍(lán)（B. oleracea，CC）為親本，通過遠(yuǎn)緣雜交和人工加倍獲得蕓薹屬異源六倍體蔬菜（AABBCC）。該六倍體能作為橋梁作物，合成不同種類的異附加系、漸滲系等，滿足不同育種需求。饒琳莉（2015）將莖瘤芥和紫甘藍(lán)雜交得到的異源六倍體（AABBCC）分別與莖瘤芥和大白菜進(jìn)行雜交，成功得到基因組為AABBC與AABC的蕓薹屬新種質(zhì)，新種質(zhì)表現(xiàn)出獨(dú)特的植物學(xué)性狀，有望通過AABBC再與親本莖瘤芥AABB回交選育出莖瘤芥異附加系。

2 種間嫁接

嫁接（grafting）是植物的一種無性繁殖方式，它是將植物體的器官、組織接到另一植物的適當(dāng)部位，使兩者接口愈合，長成為一個新植株的技術(shù)（李繼華，1990）。由于嫁接具有快速更新品種、增強(qiáng)植物環(huán)境適應(yīng)性、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，特別是在果樹、觀賞樹木、茄科蔬菜及瓜類作物的繁殖和育種上發(fā)揮了巨大作用。然而，由于蕓薹屬蔬菜的生產(chǎn)方式有別于茄科作物及瓜類作物，嫁接技術(shù)一般不被應(yīng)用于蕓薹屬蔬菜生產(chǎn)。

近年來，蕓薹屬蔬菜嫁接試驗(yàn)的開展主要是為春化機(jī)理等理論問題的解析提供試驗(yàn)體系。例如，陶鵬等（2017）將需要綠體春化的結(jié)球甘藍(lán)嫁接于常年抽薹的薹菜（菜心）砧木上，即使在不經(jīng)過綠體春化的情況下，結(jié)球甘藍(lán)也能抽薹開花，該現(xiàn)象表明春化相關(guān)的信號物質(zhì)可能通過嫁接砧木、接穗之間的互作得到了交流，并且改變了接穗的開花習(xí)性。

物種之間的嫁接是否會改變嫁接當(dāng)代及其后代的遺傳信息，一直是國際上的研究熱點(diǎn)。由于嫁接的本質(zhì)是異源細(xì)胞的相互交流，因此Hirata等（1990）開創(chuàng)性地提出了通過莖尖嫁接人工創(chuàng)建種間細(xì)胞的交流體系，即種間嵌合體。迄今為止，已經(jīng)獲得了蘿卜與紫甘藍(lán)嫁接嵌合體（Hirata et al.，2000）、莖瘤芥與紫甘藍(lán)嫁接嵌合體（Chen et al.，2006）等。近年來的研究表明，莖瘤芥與紫甘藍(lán)嵌合體自交后代表現(xiàn)出葉形、頂端分生組織等方面可遺傳的變異，成為新的莖瘤芥種質(zhì)資源（Li et al.，2013；Cao et al.，2016）。因此，蕓薹屬蔬菜物種之間的莖尖嫁接為種質(zhì)資源的創(chuàng)制提供了一條嶄新的途徑。

3 體細(xì)胞雜交

植物體細(xì)胞雜交（somatic hybridization）又稱原生質(zhì)體融合（protoplast fusion），是指雙親的原生質(zhì)體在特定的物理或化學(xué)因素作用下誘導(dǎo)融合成雜種細(xì)胞，通過細(xì)胞分裂并分化和再生出植株。由于蕓薹屬蔬菜較易進(jìn)行原生質(zhì)體操作，因而體細(xì)胞雜交被廣泛運(yùn)用在蕓薹屬蔬菜的種質(zhì)創(chuàng)新中（表2）。體細(xì)胞雜交能有效克服有性雜交不親和性，跨越生殖隔離，創(chuàng)造異源多倍體新種質(zhì)，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)在種、屬間的無性轉(zhuǎn)移。例如，Lian等（2011a，2011b）分別以葉用芥菜和青花菜、青花菜和大白菜為供受體親本，采用40%聚乙二醇融合法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，獲得具有雙親基因組的異源四倍體再生植株。

表2 體細(xì)胞雜交在蕓薹屬蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用

然而，細(xì)胞對稱融合在導(dǎo)入有用基因的同時，也帶入了供體親本的全部不利基因，且兩套基因組的融合常常導(dǎo)致雜種后代敗育。近年來，不對稱細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和利用為解決細(xì)胞對稱融合過程中不利基因的導(dǎo)入及后代的敗育等問題提供了一條有效途徑。例如：通過非對稱體細(xì)胞雜交技術(shù)，黑芥的抗黑腐病基因、Ogura CMS等細(xì)胞質(zhì)雄性不育源先后被轉(zhuǎn)育到花椰菜等甘藍(lán)類蔬菜及蕓薹屬其他蔬菜中，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)良性狀在細(xì)胞之間的快速轉(zhuǎn)移（Sigareva & Earle，1997；張麗 等，2008；Wang et al.，2011，2016）。

4 分子育種

分子育種主要分為基因工程育種和分子標(biāo)記輔助育種。基因工程育種是以植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體為受體系統(tǒng)，導(dǎo)入目的基因，改良農(nóng)作物遺傳性狀的一種育種方法。近年來，隨著基因工程的發(fā)展，蕓薹屬蔬菜中越來越多的優(yōu)異性狀基因被克隆。例如：莖瘤芥膨大相關(guān)基因BjuB.RBR.b、BjuA.RBR.b、BjAPY2、orf451（Shi et al.，2014；羅天寬 等，2015；Cao et al.，2015），普通白菜花粉發(fā)育相關(guān)基因BcMF23a、BcMF23b（Lin et al.，2016）等。但是，由于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因存在安全隱患，轉(zhuǎn)基因蕓薹屬蔬菜的生產(chǎn)應(yīng)用一直備受爭議。最近，基因定點(diǎn)編輯整合技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)被逐步運(yùn)用到蕓薹屬蔬菜的遺傳改良中。例如，Lawrenson等（2015）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將甘藍(lán)DH1012中編碼赤霉素合成基因BolC.GA4的定點(diǎn)敲除，實(shí)現(xiàn)了植株的矮化。該項(xiàng)技術(shù)將逐步消除轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全隱患，有望運(yùn)用在蕓薹屬蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新上的生產(chǎn)實(shí)踐中。

分子標(biāo)記輔助育種是指利用分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的特點(diǎn)，通過檢測分子標(biāo)記，即可檢測到目的基因的存在，達(dá)到選擇目標(biāo)性狀的目的。目前為止，分子標(biāo)記在蕓薹屬蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新中得到了較為廣泛的應(yīng)用，特別是抗病抗逆、品質(zhì)、發(fā)育、育性等重要農(nóng)藝性狀的分子育種方面。由于大多數(shù)農(nóng)藝性狀均屬于數(shù)量性狀，借助QTL連鎖的分子標(biāo)記能夠大大提高對數(shù)量性狀的遺傳操縱能力，從而提高育種工作中對數(shù)量性狀優(yōu)良基因型的選擇準(zhǔn)確性。張郎郎等（2014）利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建了莖瘤芥莖膨大的連鎖圖譜，采用復(fù)合區(qū)間作圖法定位到控制瘤狀莖質(zhì)量性狀和橫徑性狀各2個，共解釋分別為43.28%和53.27%的表型變異。Li等（2016）以莖瘤芥和葉用芥菜為親本構(gòu)建了F2作圖群體，利用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了包含17個連鎖群的芥菜遺傳圖譜，基于SSR圖譜檢測到4個控制莖質(zhì)量的QTL位點(diǎn)，為控制莖瘤芥瘤狀莖膨大性狀相關(guān)基因的精確定位打下基礎(chǔ)。張曉偉等（2009）通過構(gòu)建大白菜DH群體，對TuMV-C4株系的苗期抗性進(jìn)行QTL定位，檢測到了3個QTL位點(diǎn)。由于分子育種能定向選育新品種，且克服了常規(guī)育種周期長、種屬間隔離等缺點(diǎn)，已經(jīng)成為蕓薹屬蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新的重要輔助手段。

5 展望

迄今為止，國內(nèi)外利用遠(yuǎn)緣雜交、種間嫁接、體細(xì)胞雜交、分子育種等手段進(jìn)行的蕓薹屬蔬菜遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新已經(jīng)取得了一系列的重要進(jìn)展，培育了大量具有抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)等優(yōu)異性狀的蕓薹屬蔬菜新種質(zhì)。但是目前這些育種手段及獲得的新種質(zhì)的利用仍然存在一定的局限性。遠(yuǎn)緣雜交的主要問題表現(xiàn)為雜種后代存在定向選擇目標(biāo)性狀困難，優(yōu)良性狀穩(wěn)定耗時長，需要多代自交與回交等。因此，未來遠(yuǎn)緣雜交要與分子育種相結(jié)合，通過小孢子培養(yǎng)，利用分子標(biāo)記輔助選擇在早期確定目的基因或者染色體，這也是遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)將來的主要發(fā)展方向。通過種間嫁接嵌合體合成雖然可以獲得可遺傳的變異，但是嵌合體作為一種特殊形式的嫁接，其合成具有一定的難度；而且，到目前為止嫁接引起遺傳變異的分子機(jī)制尚未清楚，因此種間嫁接在蕓薹屬蔬菜遺傳改良中存在一定的局限性。體細(xì)胞雜交是建立在原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，高效再生體系的缺乏使這項(xiàng)技術(shù)在蕓薹屬蔬菜種質(zhì)改良的應(yīng)用中受到了一定的阻礙。分子育種是近年來發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，但到目前為止在蕓薹屬豐富的遺傳資源中挖掘到的優(yōu)良基因還有限，且分子標(biāo)記輔助育種還處于初級定位階段，很少能做到精細(xì)定位。

相信隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，育種技術(shù)與育種手段將會不斷得到完善；同時，也應(yīng)該充分發(fā)揮各育種手段的優(yōu)勢，實(shí)施多種育種技術(shù)相結(jié)合的策略，為蕓薹屬蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新提供更多的親本資源，實(shí)現(xiàn)蕓薹屬蔬菜育種的重大突破。

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