葛根素在腦缺血再灌注損傷時(shí)對(duì)局部腎素—血管緊張素系統(tǒng)的影響

王澤+張永濤+李珊

[摘要] 目的 探討葛根素在腦缺血再灌注損傷（IRI）時(shí)對(duì)腦組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的影響。 方法 選擇Wistar大鼠60只，并按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組（假手術(shù)）、模型組（線栓法成功制造大鼠腦IRI）和治療組（線栓法成功制造大鼠腦IRI的同時(shí)給予葛根素進(jìn)行干預(yù)）；術(shù)后24 h處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并采用Zea-Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠的神經(jīng)功能，HE染色觀察大鼠腦組織的變性細(xì)胞指數(shù)（DCI），放射免疫法、Real-time PCR、Western blot檢測(cè)大鼠腦組織RAS主要組分[血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、血管緊張素Ⅱ 1型和2型受體（AT1R和AT2R）]的表達(dá)。 結(jié)果 模型組和治療組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、DCI、AngⅡ、ACE、AT1R和AT2R均明顯高于對(duì)照組（P < 0.05），當(dāng)給予葛根素干預(yù)后，治療組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和DCI均較模型組下降（P < 0.05），同時(shí)伴隨著腦組織局部RAS主要組分的下降（P < 0.05）。 結(jié)論 葛根素對(duì)大鼠腦IRI的保護(hù)作用可能與其抑制了腦組織局部RAS有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注損傷；葛根素；腎素-血管緊張素系統(tǒng)

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（b）-0009-05

[Abstract] Objective To explore the effect of puerarin on the local cerebrum renin-angiotensin system （RAS） in cerebral ischemia reperfusion injury （IRI）. Methods A total of 60 Wistar rats were selected and divided into the control group （sham operation）， the model group （rats in the model group were established as cerebral IRI model by inserting a monofilament into middle cerebral artery） and the treatment group （rats in the treatment group were administered with puerarin after the cerebral IRI model was established） by random number table method. All rats were sacrificed 24 h after operation. The neurological function of rats was evaluated by Zea-Longa method. The denatured cell index （DCI） in cerebrum was observed by HE staining. Main components of renin-angiotensin system including angiotensinⅡ （AngⅡ）， angiotensin converting enzyme （ACE）， angiotensin type 1 receptors （AT1R） and angiotensin type 2 receptors （AT2R） were determined using radioimmunoassay， Real-time PCR and Western blot. Results The neurological function scores， DCI， AngⅡ， ACE， AT1R and AT2R in the model group and the treatment group rats increased significantly compared with those in the control group （P < 0.05）. The neurological function scores and DCI after puerarin treatment were decreased significantly compared with those in the model group （P < 0.05）， in the meantime， the main components of renin-angiotensin system were also inhibited by puerarin （P < 0.05）. Conclusion The protective effect of puerarin on cerebral IRI in rats may have certain relationship to the inhibitory of the local RAS in cerebrum.

[Key words] Cerebral ischemia reperfusion injury； Puerarin； Renin-angiotensin system

葛根素是提取于豆科葛屬植物野葛的干燥根中的異黃酮類化合物。研究表明葛根素對(duì)腦缺血再灌注損傷（IRI）具有很好的保護(hù)作用[1-4]，但對(duì)于其作用機(jī)制并未完全闡明。組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是近幾年被人們發(fā)現(xiàn)的，與全身RAS具有相同組分，但相對(duì)獨(dú)立的調(diào)控系統(tǒng)，同樣包括血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素Ⅱ 1型和2型受體（AT1R和AT2R）和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）[5]。研究表明葛根素對(duì)心肌局部RAS的抑制作用是其保護(hù)心肌損傷的主要機(jī)制之一[6]。而局部RAS同樣存在于腦組織中，并且參與了腦IRI的發(fā)病過程[7]。但關(guān)于葛根素對(duì)腦IRI的保護(hù)作用是否與局部RAS有關(guān)，目前尚不十分清楚。本研究將利用大鼠腦IRI模型，通過分子生物學(xué)來驗(yàn)證葛根素對(duì)腦IRI的保護(hù)作用是否與局部RAS有關(guān)。endprint

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組

選取8周齡雄性SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體重200～250 g，購自青島市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（魯）20100010]。將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，即對(duì)照組、模型組和治療組，每組20只。模型組采用線栓法[8]制造腦IRI模型，即缺血2 h/再灌注22 h模型，術(shù)后2 h采用Zea-Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法[9]對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，得分在1～3分之間代表模型成功，可將大鼠納入后續(xù)研究，否則將大鼠剔除研究。在治療組中，造模成功的同時(shí)按照100 mg/kg的劑量給予大鼠腹腔注射葛根素（山東方明藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1611187）。對(duì)照組未給予大腦中動(dòng)脈栓塞。術(shù)后24 h再次給予大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，然后處死。本研究通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員批準(zhǔn)。

1.2 HE染色

4%多聚甲醛固定大鼠腦組織，然后常規(guī)石蠟包埋，切片。將石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木精和伊紅染色，并再次經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠固定封片。顯微鏡（Leica DMI4000B，德國(guó)）下對(duì)同一部位進(jìn)行觀察，并計(jì)算變性細(xì)胞指數(shù)（denatured cell index，DCI）。具體公式如下：DCI=變性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.3 AngⅡ濃度測(cè)定

將大鼠腦組織勻漿，并用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度一致。其余步驟按照AngⅡ放射免疫試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）說明書操作。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 ACE活性測(cè)定

按上述方法提取大鼠腦組織蛋白，然后將蛋白勻漿與ACE的底物-馬尿酸甘氨酰甘氨酸混勻，37℃水浴30 min，用乙酸乙酯提取混合液中的馬尿酸成分，并用氯化鈉充分溶解中，最后用紫外分光法測(cè)定混合液中馬尿酸量，從而間接測(cè)定腦組織內(nèi)ACE活性。其活性單位為每分鐘nmol/mg蛋白。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Real-time PCR分析

RNA提取試劑盒（陜西先鋒生物科技有限公司）提取組織內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas，加拿大）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）于熒光定量PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增分析。具體引物序列見表1。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并利用2-ΔΔCt的方法對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.6 Western-blot分析

按上述方法提取大鼠腦組織蛋白，然后按常規(guī)方法依次進(jìn)行蛋白變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，然后加入抗大鼠AT1R（Santa Cruz，美國(guó)）、AT2R（Abcam，美國(guó)）和ACE（Abcam，美國(guó)）抗體4℃過夜。第2天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，然后顯影。用GAPDH（Santa Cruz，美國(guó)）作為內(nèi)參，采用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較

術(shù)后2 h大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，模型組12只大鼠造模成功[評(píng)分1～3分，平均（2.17±0.83）分]，治療組13只大鼠造模成功[評(píng)分1～3分，平均（2.23±0.83）分]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。術(shù)后24 h大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[評(píng)分1～2分，平均（1.31±0.48）分]明顯低于模型組[評(píng)分1～3分，平均（1.92±0.79）分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。對(duì)照組大鼠死亡2只，術(shù)后2 h和24 h評(píng)分均為0分。

2.2 大鼠腦組織病理學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織內(nèi)可見細(xì)胞排列紊亂，胞核固縮，細(xì)胞形態(tài)不完整；而治療組大鼠腦組織區(qū)內(nèi)病變細(xì)胞的數(shù)量明顯低于模型組；對(duì)照組大鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞基本完整（圖1）。通過對(duì)三組大鼠腦組織DCI比較發(fā)現(xiàn)，模型組和治療組大鼠腦組織的DCI明顯高于對(duì)照組（均P < 0.05）；而治療組大鼠腦組織的DCI較模型組明顯降低（P < 0.05）（表2）。

2.3 大鼠腦組織AngⅡ濃度和ACE活性的比較

模型組和治療組中大鼠腦組織AngⅡ濃度和ACE活性較對(duì)照組明顯升高（均P < 0.05）；治療組大鼠腦組織中AngⅡ濃度和ACE活性較模型組明顯下降（P < 0.05）（表3）。

2.4 大鼠腦組織ACE、AT1R和AT2R蛋白和mRNA水平的比較

模型組和治療組大鼠腦組織ACE、AT1R和AT2R的蛋白和mRNA表達(dá)較對(duì)照組均明顯升高（均P < 0.05）；治療組大鼠腦組織ACE、AT1R和AT2R的蛋白和mRNA表達(dá)較模型組均明顯下降（均P < 0.05）（圖2、表4～5）。

3 討論

近年來，隨著人們對(duì)RAS的研究，發(fā)現(xiàn)RAS不僅存在于全身內(nèi)分泌循環(huán)系統(tǒng)，它也在于局部組織器官中，包括心臟、腎臟和肺臟等。存在于局部組織器官中的RAS，即為組織局部RAS。組織局部RAS是與全身RAS具有相同組分，但相對(duì)獨(dú)立的調(diào)控系統(tǒng)，并且它在組織器官中發(fā)揮著特有的生物學(xué)作用[5]。

最近報(bào)道，腦組織中同樣存在著局部RAS，并且參與了腦缺血性再灌注損傷的病理過程[10-13]。Nakagawa等[10]發(fā)現(xiàn)，過度激活RAS通過增加炎癥因子和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起腦損傷。還有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)，過度激活的RAS可通過氧化應(yīng)激增加腦損傷，而AT1R阻斷劑可以抑制氧化應(yīng)激，進(jìn)而保護(hù)腦組織。Zhang等[12]學(xué)者證實(shí)，激活的腦組織局部RAS可通過促進(jìn) C-JUN氨基末端激酶的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腦細(xì)胞凋亡，而AT1R阻斷劑可以減少細(xì)胞凋亡，從而改善腦IRI。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在發(fā)生腦IRI的同時(shí)，腦組織局部RAS的主要組分均明顯升高。綜上所述，目前的研究和本研究均表明，組織局部RAS不僅存在于腦組織中，而且在腦IRI中發(fā)揮重要作用。endprint

研究表明葛根素具有明顯抑制RAS的作用[14]。吳黎明等[15]發(fā)現(xiàn)，葛根素通過NF-κB信號(hào)通路抑制心肌組織局部RAS的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)心肌IRI。郭亞東等[16]發(fā)現(xiàn)，葛根素聯(lián)合替米沙坦通過抑制RAS的過度激活，進(jìn)而減輕肥胖和改善胰島素抵抗。高靜媛等[6]發(fā)現(xiàn)，葛根素通過抑制糖尿病大鼠RAS，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。這些研究均已表明葛根素可以通過抑制組織局部RAS的激活，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)療效，而葛根素對(duì)腦IRI的保護(hù)作用已是不爭(zhēng)的事實(shí)[1]，其機(jī)制包括減輕興奮性氨基酸毒性[17-18]、減輕炎性反應(yīng)[19-20]、抑制細(xì)胞凋亡[21]和減輕腦水腫[4]等。但是，葛根素對(duì)腦組織局部RAS的抑制作用是否也是其保護(hù)腦組織的機(jī)制之一，目前尚不十分清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)給予葛根素干預(yù)后，治療組大鼠的腦IRI較模型組明顯減輕，同時(shí)伴有腦組織局部RAS主要組分明顯降低，這提示葛根素治療大鼠腦IRI的作用可能與其抑制腦組織局部RAS有關(guān)，為葛根素治療大鼠腦IRI提供了新的可能機(jī)制。

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（收稿日期：2017-10-04 本文編輯：張瑜杰）endprint