PtrDREB28轉(zhuǎn)錄因子的克隆及抗逆性1)

劉海妹 陳韻琳 李成浩

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

在自然條件下，由于植物體自身不能移動導(dǎo)致其生存環(huán)境相對固定，因此，干旱和高鹽等逆境條件成為干擾植物正常生長發(fā)育的主要因素[1]。那么為了維持植物體自身在逆境條件下的正常生長和發(fā)育，其通過建立各種脅迫應(yīng)答機制來抵抗各種逆境條件[2]。目前，許多草本植物中響應(yīng)脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子基因已經(jīng)被克隆出來[3]，如AP2/EREBP、ABRE、MYB/C和NAC等，其中AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子是植物體特有的，并且在逆境應(yīng)答脅迫中起著至關(guān)重要的作用。按照DNA結(jié)合不同的結(jié)構(gòu)域AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子分為AP2、DREB、ERF、RAV和其他等5個亞族[4]。其中DREB亞族又分為6個亞群(A-1～A-6)。A-2亞群的DREB轉(zhuǎn)錄因子可通過與DRE順式作用原件結(jié)合，進而調(diào)控響應(yīng)干旱、高鹽等逆境脅迫相關(guān)的基因表達[5]。但目前對于該類轉(zhuǎn)錄因子的研究和報道大多數(shù)還僅限于擬南芥、水稻等草本模式植物中，而以木本植物為對象的研究較少。楊樹分布廣、適應(yīng)性強、生長速度快、遺傳轉(zhuǎn)化率較高[6]，是基因工程重要的受體樹種之一。我國作為世界上鹽堿地面積最大的國家之一，研究楊樹應(yīng)答鹽脅迫的分子機理，篩選出耐鹽關(guān)鍵基因，對進一步利用基因工程技術(shù)改良楊樹耐鹽性具有重要作用。

本研究從毛果楊中克隆A-2亞群DREB轉(zhuǎn)錄因子基因PtrDREB28基因，構(gòu)建植物過表達載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行大青楊遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因大青楊株系。通過非生物脅迫及生理指標的測定初步確定得到耐高鹽的轉(zhuǎn)基因大青楊株系。雖然關(guān)于DREB轉(zhuǎn)錄因子提高植物抗逆性的報道很多，但目前來看DREB轉(zhuǎn)錄因子的過表達也很容易引起轉(zhuǎn)基因植株矮化或生長延緩現(xiàn)象[7]，而本研究最大的優(yōu)勢是PtrDREB28轉(zhuǎn)錄因子基因不但提高了楊樹的耐鹽能力，而且不會影響楊樹的正常生長。

1 材料與方法

用于提取植物總RNA的毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室。大腸桿菌感受態(tài)DH5α和根癌農(nóng)桿菌EHA105為本實驗室保存，克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司，植物表達載體為pBI121，攜帶35S CAMV啟動子、綠色熒光蛋白基因(gfp)和卡那霉素篩選標記基因(npt-II)。

1.1 PtrDREB28基因編碼區(qū)引物序列

根據(jù)實驗室前期對PtrDREB28轉(zhuǎn)錄因子所在的DREB亞族的生物信息學(xué)分析，并對野生型毛果楊進行了不同時間的脅迫處理，發(fā)現(xiàn)該基因被誘導(dǎo)，推測其功能與響應(yīng)非生物脅迫相關(guān)。PtrDREB28基因在NCBI中檢索(登錄號為：XM_002324616.1)，根據(jù)檢索的ORF序列設(shè)計引物，上游引物F：5’-ATGGTGCAGTCAAAAAAGTT-3’，下游引物R：5’-CTAAAGAAAAAGGCTACCGTC-3’。CTAB法提取毛果楊植株的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，用膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒進行膠回收和純化，與pMD18-T Vector載體鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，接種到含氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進行菌液PCR檢測和測序。

1.2 植物過表達載體pBI121-PtrDREB28-GFP的構(gòu)建方法

設(shè)計帶有XbaⅠ和SalⅠ酶切位點的引物，上游引物為F:5’-GCTCTAGAGATGGTGCAGTCCAAGAAG-3’，下游引物為R：5’-GCGTCGACGAAGAAAAAGGCTACC-3’。提取pMD18-T-PtrDREB28的質(zhì)粒，進行PCR擴增目的片段。利用XbaⅠ和SalⅠ的特異性酶切位點分別對過表達載體pBI121和純化的目的片段進行雙酶切，用T4-DNA連接酶對兩者進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，新的重組質(zhì)粒經(jīng)過菌液PCR檢測和卡那霉素篩選后，獲得pBI121-PtrDREB28-GFP植物過表達載體，用電擊法將其轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中。

1.3 亞細胞定位

用質(zhì)粒小提試劑盒提取pBI121-PtrDREB28-GFP和pBI121-GFP質(zhì)粒備用。撕取新鮮洋蔥的倒數(shù)第2～4層鱗莖內(nèi)表皮，用基因槍(Biolistic? PDS-1000)將pBI121-PtrDREB28-GFP質(zhì)粒和對照質(zhì)粒DNA(pBI121-GFP)轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細胞。培養(yǎng)皿室溫下暗培養(yǎng)12～48 h后，將激光共聚焦掃描顯微鏡激發(fā)波長調(diào)整為488 nm進行觀察。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大青楊

將活化培養(yǎng)制備好的工程菌4 000 r/min離心5 min，1/2MS液體培養(yǎng)基重懸。在無菌工作臺中，剪取大青楊組培苗上部第3～4片葉片，切除葉尖1/2部分，放入菌液中侵染20 min。葉子用無菌濾紙吸干菌液后，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)中共培養(yǎng)2 d。然后用添加200 mg/L的頭孢霉素水清洗3～5次，濾紙吸去表面水分后，放入添加200 mg/L cef和50 mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基置于暗處進行篩選培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織生成。待愈傷組織足夠大將其移至光下培養(yǎng)，待大青楊叢生芽長成苗，放入生根培養(yǎng)基(不添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的1/2MS培養(yǎng)基)中，生根培養(yǎng)基中含50 mg/L Kan和200 mg/L Cef。提取轉(zhuǎn)基因大青楊DNA和RNA(CTAB法)，進行分子檢測。

1.5 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因大青楊幼苗的抗逆性

將野生型大青楊和轉(zhuǎn)基因大青楊株系L2、L8和L15的組培苗各取5～8株在添加80 mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，觀察并比較野生型和轉(zhuǎn)基因株系的生長與生根情況，對其耐鹽性進行評價，每組試驗進行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因大青楊生理指標的測定

丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的測定：對照和過表達轉(zhuǎn)基因大青楊株系L2、L8和L15組培苗，80 mmol/L NaCl脅迫一周后分別取植株上部第3片葉片，稱取鮮樣0.1 g，利用分光光度計法并參照Dhindsa et al.[8]的實驗方法測定丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，每次測定進行3次生物學(xué)重復(fù)。

相對電導(dǎo)率的測定：將在正常條件下組織培養(yǎng)2周后的野生型和轉(zhuǎn)基因大青楊株系分別進行80 mM NaCl脅迫一周，然后分別取野生型和轉(zhuǎn)基因植株同樣大小的葉片，快速稱取鮮樣3份，每份0.1 g，分別加入50 mL的蒸餾水，3～5 h后，用電導(dǎo)儀測其電導(dǎo)值S1，將玻璃瓶置于水浴鍋中90 ℃熱浴30 min，冷卻到室溫，測其電導(dǎo)值S2，相對電導(dǎo)值為S1/S2，進行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrDREB28基因編碼區(qū)的克隆

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴增出PtrDREB28目的片段(圖1)，約為621 bp，與預(yù)期吻合，將該段目的片段回收后與pMD18-T載體連接，經(jīng)菌液PCR驗證和測序結(jié)果表明該基因已經(jīng)克隆到pMD18-T載體上。

2.2 植物過表達載體pBI121-PtrDREB28-GFP的構(gòu)建

新獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR驗證后得到大小約為621 bp的片段(圖2)，與預(yù)期結(jié)果吻合，獲得植物表達載體pBI121-PtrDREB28-GFP。電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌后，經(jīng)菌液PCR鑒定后保存菌液用于后續(xù)試驗。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.PtrDREB28基因PCR擴增產(chǎn)物。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位

質(zhì)粒pBI121-PtrDREB28-GFP和陽性對照質(zhì)粒pBI121-GFP利用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞后，激光共聚焦顯微鏡下觀察洋蔥表皮細胞中的熒光信號。結(jié)果表明(圖3)，pBI121-GFP在整個細胞內(nèi)都有GFP綠色熒光分布，pBI121-PtrDREB28-GFP只在洋蔥表皮細胞核內(nèi)有綠色熒光，說明PtrDREB28轉(zhuǎn)錄因子定位在細胞核。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.pBI121-PtrDREB28-GFP菌液PCR產(chǎn)物。

圖2 pBI121-PtrDREB28-GFP植物表達載體構(gòu)建

圖3 PtrDREB28基因的亞細胞定位

2.4 PtrDREB28基因過表達轉(zhuǎn)基因大青楊的篩選與檢測

把構(gòu)建好的植物表達載體pBI121-PtrDREB28-GFP用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到野生型大青楊。待在抗性培養(yǎng)基上篩選后得到的轉(zhuǎn)基因植株生根生長狀態(tài)統(tǒng)一時，剪取每個株系同一部位的葉片2～3片分別提取DNA進行PCR檢測(圖4-A)，檢測時使用pBI121-PtrDREB28-GFP質(zhì)粒作為陽性對照，使用野生型大青楊DNA作為陰性對照，檢測結(jié)果顯示除13號以外的所有株系都有目的條帶。初步說明PtrDREB28基因已經(jīng)成功插入到大青楊基因組中。對轉(zhuǎn)基因植株的葉片提取RNA進行RT-PCR檢測(圖4-B)，說明該基因能夠過量表達，共獲得16個轉(zhuǎn)基因株系。其中挑選2、8、15號用于后續(xù)實驗。

2.5 鹽脅迫下野生型大青楊與轉(zhuǎn)基因大青楊幼苗的抗逆性比較

對組培苗的生長發(fā)育性狀的比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因株系和野生型大青楊無顯著差異。將正常培養(yǎng)20 d的轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的組培苗，測量根長和株高后，剪取植株上部帶有3～4片葉子的2 cm左右莖段，轉(zhuǎn)到添加80 mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后，觀察葉片受損程度和根系生長情況，如圖5結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因株系L2、L8、L15號和野生型大青楊葉片均受損，但野生型葉片大部分變黑，而轉(zhuǎn)基因株系的葉片只是輕微受損，大部分仍然保持綠色；轉(zhuǎn)基因植株的根系明顯較野生型植株根系生長旺盛；通過統(tǒng)計測量根長長度(見表1)，結(jié)果表明：在正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的根長基本一致，經(jīng)80 mmol/L NaCl脅迫處理20 d后，雖然轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株根部生長均受抑制，但轉(zhuǎn)基因株系根長顯著高于野生型植株；通過統(tǒng)計測量株高(見表2)，結(jié)果表明：在正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的株高基本無差異，經(jīng)80 mmol/L NaCl脅迫處理20 d后，雖然轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株生長均受抑制，但轉(zhuǎn)基因株系顯著高于野生型植株；以上結(jié)果表明過量表達PtrDREB28基因提高了轉(zhuǎn)基因大青楊的耐鹽性。

A.轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA水平PCR檢測;B.轉(zhuǎn)基因植株葉片RNA水平PCR檢測;M.DL2000 DNA Marker;+.陽性對照;-.陰性對照;1-22.轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA;1-12,14-22.轉(zhuǎn)基因植株葉片cDNA。

圖4轉(zhuǎn)基因植株葉片分子水平PCR檢測

圖5 80 mmol/L NaCl脅迫處理下野生型大青楊和轉(zhuǎn)基因大青楊表型

表1 80 mmol/L NaCl脅迫處理下野生型大青楊和轉(zhuǎn)基因大青楊根長統(tǒng)計 cm

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準誤”；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 鹽脅迫下野生型大青楊和轉(zhuǎn)基因大青楊生理指標的測定

2.6.1 丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的測定

丙二醛質(zhì)量摩爾濃度比較結(jié)果見表3：在正常條件下培養(yǎng)的野生型大青楊和轉(zhuǎn)基因大青楊株系的MDA質(zhì)量摩爾濃度基本一致，但在同樣的鹽脅迫處理下，3個轉(zhuǎn)基因株系的MDA質(zhì)量摩爾濃度均顯著低于野生型，表明轉(zhuǎn)PtrDREB28基因的大青楊抗逆性顯著高于野生型。

表2 80mmol/L NaCl脅迫處理下野生型大青楊和轉(zhuǎn)基因大青楊株高統(tǒng)計 cm

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準誤”；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6.2 相對電導(dǎo)率的測定

相對電導(dǎo)率是衡量細胞膜透性情況的一個生理指標。我們通過測定相對電導(dǎo)率比較鹽脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因大青楊細胞的損壞程度。結(jié)果見表4，在鹽脅迫處理前，轉(zhuǎn)基因與野生型植株的相對電導(dǎo)率差異不大，在鹽脅迫后，野生型植株的相對電導(dǎo)率顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，說明通過PtrDREB28基因的過表達使得轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下，細胞膜的受損傷程度降低，鹽脅迫耐受能力得到提高。

表3 80mmol/L NaCl脅迫處理下大青楊葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度的測定 mol·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準誤”；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表4 80 mmol/L NaCl脅迫處理下大青楊葉片的電導(dǎo)率測定 %

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準誤”；同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)DREB類轉(zhuǎn)錄因子可以顯著提高植物的抗逆性[9]。本研究根據(jù)楊樹DREB序列，利用RT-PCR技術(shù)從毛果楊中克隆得到了A-2亞群DREB轉(zhuǎn)錄因子PtrDREB28基因。構(gòu)建植物過表達載體，通過亞細胞定位證實PtrDREB28是一個核蛋白，與前人研究的轉(zhuǎn)錄因子亞細胞定位特性符合[10]。

A-2亞群的DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答干旱、高鹽等非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。為了研究楊樹A-2亞群DREB類轉(zhuǎn)錄因子PtrDREB28的功能，本文構(gòu)建了PtrDREB28基因融合GFP表達載體,并成功獲得過表達轉(zhuǎn)基因株系，同時發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因株系組培苗在鹽脅迫下的生長狀況顯著優(yōu)于野生型。為了進一步研究PtrDREB28過表達轉(zhuǎn)基因楊樹在鹽脅迫耐受性的影響，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株在相同環(huán)境條件下進行同樣的鹽脅迫處理，通過測定其各自體內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度和相對電導(dǎo)率來比較細胞受損傷程度[11]，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的細胞受損程度顯著低于野生型植株，表明PtrDREB28基因在大青楊中過表達可顯著提高植株的耐鹽性。有研究表明，在草本植物擬南芥中，A-2亞群DREB轉(zhuǎn)錄因子家族中的AtDREB1A過表達轉(zhuǎn)基因小麥的耐鹽性顯著提高[12]；周偉等[13]將山葡萄VaDREB基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性顯著提高。但Liu et al.[14]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtDREB2A基因能響應(yīng)鹽脅迫，但過表達擬南芥植株的耐鹽性并沒有得到提高。初步推測不是所有能響應(yīng)脅迫的DREB類轉(zhuǎn)錄因子都能提高植物的抗逆性，不同物種中DREB亞族的不同基因，其對非生物脅迫的應(yīng)答機制可能不同。

許多DREB亞族的基因在植物體中過表達后，轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性得到提高，但有時也會表現(xiàn)出嚴重的生長滯后現(xiàn)象，這對于植物生長發(fā)育十分不利。已有研究表明，過表達OsDREB1A轉(zhuǎn)基因擬南芥在低溫和鹽脅迫下抗性顯著提高，并表現(xiàn)出嚴重的生長遲緩和矮化[15]；也有研究指出，在大豆中過表達MsDREB1基因，轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下抗性顯著提高，但卻出現(xiàn)明顯的發(fā)育滯后現(xiàn)象。而本研究中，PtrDREB28轉(zhuǎn)基因大青楊組培苗在鹽脅迫下的生長狀態(tài)顯著好于野生型，值得一提的是，與對照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株在正常生長條件下并沒有出現(xiàn)生長遲緩和植株矮化現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)對植物基因工程技術(shù)育種具有重要意義，但其具體抗逆機理還有待進一步研究。

本研究中我們分析了PtrDREB28基因在大青楊中的過量表達在植物抗逆方面的作用，發(fā)現(xiàn)PtrDREB28轉(zhuǎn)基因大青楊植株耐鹽性提高，表明該基因在植物高鹽脅迫應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用，并且不會影響植株的正常生長發(fā)育，為今后利用植物基因工程技術(shù)提高楊樹抗逆性提供了優(yōu)質(zhì)基因資源。

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