斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌的16S rDNA分子鑒定及PCR-SSCP分析

胡秀彩，呂愛(ài)軍，孫敬鋒，石洪玥，YEONG Yiksung，裴超，張超，李莉

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384；2.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007)

斑馬魚(yú)Danio rerio個(gè)體較小，性成熟期短，繁殖力強(qiáng)，胚胎透明且體外發(fā)育，易于活體觀察，便于研究其遺傳發(fā)育、生理病理和疾病免疫功能[1]。目前，斑馬魚(yú)已成為研究人類、動(dòng)物和魚(yú)類疾病的一種水生模式動(dòng)物[1-2]。

魚(yú)類腸道微生物是影響其生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)的重要因素之一。研究表明，魚(yú)類腸道正常菌群在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、免疫反應(yīng)和器官發(fā)育等方面具有重要作用，且影響魚(yú)類的生長(zhǎng)、發(fā)育、生理和病理[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)腸道微生物的研究主要集中在畜禽動(dòng)物，而對(duì)魚(yú)類腸道菌群組成的研究報(bào)道尚少[3-5]。對(duì)于魚(yú)類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的分析鑒定需要建立快速、準(zhǔn)確的研究技術(shù)，其中單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (SSCP)是一種基于DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法[6]。而PCR-SSCP方法被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)，近年來(lái)在腸道微生物多樣性的分析上也有應(yīng)用[7-11]。為此，本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌進(jìn)行分離純化、16S rDNA基因克隆和V3區(qū)的PCR-SSCP等系統(tǒng)研究，揭示斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌種類，旨在為探討魚(yú)類腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)其生命活動(dòng)的影響提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用斑馬魚(yú)購(gòu)自江蘇省徐州市某花鳥(niǎo)市場(chǎng)。

LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、4%NaCl嗜鹽菌培養(yǎng)基由天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。

TCBS瓊脂、SS瓊脂、伊紅美藍(lán)EMB選擇培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑公司。UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司，dNTP、Taq DNA聚合酶、10×PCR反應(yīng)試劑、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程公司，pMD 18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌的分離與培養(yǎng)特性 參照胡秀彩等[5]的方法，在無(wú)菌條件下分別將菌落接種到 LB平板、4%NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、SS瓊脂、EMB選擇培養(yǎng)基上，于29℃下倒置培養(yǎng)24 h。分別挑取菌落形態(tài)特征不同的單個(gè)菌落接種到LB平板上，無(wú)菌條件下挑取單菌落多次劃線進(jìn)行分離純化。獲得純化細(xì)菌菌株于4℃下保存(試管斜面)。觀察細(xì)菌在普通瓊脂培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，并記錄菌體培養(yǎng)特性。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA提取及16S rDNA基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)斑馬魚(yú)腸道菌株在不同平板上的菌落形態(tài)、顏色、大小等，選取12株細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳后，將12株細(xì)菌的總DNA于-20℃下保存?zhèn)溆谩２捎么竽c桿菌通用引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物序列為 5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3′， 反向引物序列為 5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3′。 PCR反應(yīng)體系 (共 15 μL)： 模板1.0 μL， 正、 反向引物各 0.5 μL， Taq PCR Master Mix 7.5 μL， 加 ddH2O 5.5 μL。 反應(yīng)條件： 94 ℃下預(yù)變性4 min；94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

將PCR產(chǎn)物連接pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)pMD-18T載體 M13的正向引物序列 5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′、 反向引物序列 5′ATTACCGCGGCTGCTGG 3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證陽(yáng)性克隆由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測(cè)，用紫外線分析儀拍照觀察。

1.2.3 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 將測(cè)序獲得的16S rDNA序列，利用NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(duì) (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，基于16S rDNA序列分析，所獲得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列應(yīng)用CLUSTALX 1.8軟件進(jìn)行匹配比對(duì)，然后采用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 16S rDNA基因V3序列的PCR-SSCP分析

以細(xì)菌總DNA為模板，用正向引物序列5′CAGTCACGACGTTGTAA 3′、 反 向 引 物 序 列5′CAGGAAACAGCTATGAC 3′擴(kuò)增16S rDNA 序列。PCR反應(yīng)體系 (共15 μL)：正、反向引物各0.5 μL， Buffer 1.5 μL， Mg2+0.6 μL， dNTP 0.2 μL，Taq 酶 0.1 μL， 模板 1.5 μL， 加 ddH2O 至 15 μL。反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性4 min；94℃下變性30 s，51℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

SSCP分析依照文獻(xiàn)[5-6]進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下：取6 μL的PCR產(chǎn)物和4 μL變性緩沖液混勻，98℃下變性10 min后立即冰浴10 min，于10%PAGE中電泳，4℃、180 V條件下電泳2.5 h(Bio-Rad)；電泳后先用蒸餾水洗1～2次，再用0.1%AgNO3染色15 min，最后利用2.0%NaOH(0.2%甲醛)顯色，直至條帶清晰為止，拍照進(jìn)行SSCP帶型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)特征

從斑馬魚(yú)腸道中分離純化出12株細(xì)菌，分別命名為 Zf1、 Zf2、 Zf3、 Zf4、 Zf5、 Zf6、 Zf7、 Zf8、Zf9、Zf10、Zf11和 Zf12，在 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后12株分離細(xì)菌均為中小型菌落，多為透明或乳白色菌落。其中，菌株 Zf5、Zf6、Zf7、Zf8、Zf9在4%NaCl平板上生長(zhǎng)緩慢，菌落形態(tài)小而圓、多為乳白色，其余7個(gè)菌株生長(zhǎng)不良；菌株Zf1、Zf2、 Zf3、 Zf4分別在 TCBS、 TCBS、 EMB、 SS選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，并呈現(xiàn)出不同的顏色；菌株Zf10、Zf11和Zf12在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，呈現(xiàn)為乳白色的圓形菌落 (表1)。

2.2 腸道菌株l6S rDNA基因克隆及分子鑒定

斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌基因組總DNA電泳檢測(cè)顯示，12株細(xì)菌基因組DNA均大于2000 bp，可用作PCR擴(kuò)增16S rDNA的模板 (圖1)。

以所提取的細(xì)菌總DNA為模板進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明擴(kuò)增出Zf1～Zf12菌株的16S rDNA基因片段，大小約為1500 bp(圖2)，用PCR檢測(cè)pMD18-T/16S rDNA陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序。對(duì)斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌測(cè)序獲得的7個(gè)菌株的16S rDNA序列，利用NCBI進(jìn)行BLAST序列相似性檢索，結(jié)果見(jiàn)表2。同時(shí)結(jié)合腸道細(xì)菌形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征，確定菌株Zf1與Zf11屬于氣單胞菌屬Aeromonas，與菌株Aeromonas veronii為同一種細(xì)菌；Zf4與Zf8屬于鞘氨醇單胞菌屬 Sphingomonas，與菌株 Sphingomonas sp.為同一種菌；Zf5屬于芽孢桿菌屬Bacillus，與菌株Bacillus subtilis為同一種菌；Zf7屬于氣單胞菌屬Aeromonas，與菌株Aeromonas sp.M10為同一種菌；而Zf10與非培養(yǎng)菌株uncultured bacterium clone GI3-M-5-G01為同一種菌，可能是一種新的菌種。

表1 細(xì)菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征Tab.1 Morphological and culture characteristics of all strains

圖1 菌株Zf1-Zf12基因組總DNAFig.1 Total DNA of genome from strains Zf1 to strain Zf12 in the intestine of zebrafish

圖2 菌落PCR檢測(cè)pMD18-T/16S rDNA陽(yáng)性克隆Fig.2 Positive clones of pMD18-T/16S rDNA in the strains by PCR

表2 16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果分析Tab.2 Sequencing of the 16S rDNA from different isolates

通過(guò)構(gòu)建16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，以Zf1、Zf11為代表的菌株與已知種的細(xì)菌Aeromonas veronii聚為一支，親緣關(guān)系最近，歸在同一類群，且一致性達(dá)99%；而菌株Zf5則與Bacillus subtilis聚為一支，一致性達(dá)99%；而以Zf4、Zf8為代表的菌株則與Sphingomonas sp.未知細(xì)菌聚為一支，歸在同一類群，一致性達(dá)99%；Zf7與Aeromonas sp.未知細(xì)菌聚為一支，一致性達(dá)99%；另外一個(gè)代表菌株Zf10則與尚未獲得純培養(yǎng)的菌株聚為一支，一致性達(dá)92%。以腸道大腸埃希氏菌Escherichia cdi作為參考菌株，與各菌株分支較遠(yuǎn)，可知分離的菌種與大腸埃希氏菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 以斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of different bacterial isolates from the intestine of zebrafish based on 16S rDNA gene sequence

2.3 16S rDNA基因V3區(qū)的PCR-SSCP分析

對(duì)12株分離菌16S rDNA V3區(qū)基因的PCRSSCP圖譜顯示，斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌Zf1～Zf12的16S rDNA V3區(qū)基因存在多態(tài)性：Zf1與Zf11帶型一致；Zf4與Zf8帶型一致；而Zf5、Zf7、Zf10帶型各不相同，與前兩種帶型也有所不同 (圖4)。進(jìn)一步對(duì)其中7株腸道細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)基因序列進(jìn)行比對(duì) (圖5)，結(jié)果顯示，Zf1、Zf11序列完全相同，表明為同一種菌；Zf4、Zf8序列基本相同，為同一種菌。Zf5、Zf7、Zf10序列互不相同，且與Zf1、Zf11以及Zf4、Zf8均有較大差別，初步鑒定為不同菌種，此結(jié)果與16S rDNA-SSCP圖譜一致。

圖4 16S rDNA V3區(qū)基因的PCR-SSCP圖譜Fig.4 PCR-SSCP results of the V3 region gene of l6S rDNA of the bacteria from the intestine of zebrafish

圖5 16S rDNA基因V3區(qū)基因序列比對(duì)Fig.5 Homological analysis of 16S rDNA V3 region sequences

3 討論

3.1 魚(yú)類腸道細(xì)菌的多樣性研究

近年來(lái)，對(duì)動(dòng)物腸道微生物的研究主要集中于哺乳類動(dòng)物[12-14]，而對(duì)模式生物斑馬魚(yú)腸道菌群進(jìn)行分離鑒定的研究則鮮有文獻(xiàn)報(bào)道[1，3]。國(guó)內(nèi)對(duì)魚(yú)類腸道菌群組成的研究起步相對(duì)較晚。迄今，相關(guān)學(xué)者對(duì)大彈涂魚(yú)[15]、青石斑魚(yú)[16]腸道菌群進(jìn)行鑒定分析，并發(fā)現(xiàn)了腸道優(yōu)勢(shì)菌群與細(xì)菌種屬，認(rèn)為這些優(yōu)勢(shì)菌群可能是參與消化生理活動(dòng)的主要菌群。樊海平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，日本鰻鱺腸道中細(xì)菌數(shù)量與棲息水體、生理狀態(tài)、餌料狀況等有關(guān)。趙慶新[18]以草魚(yú)、鯉等鯉科Cyprinidate魚(yú)類為研究對(duì)象，分析了其腸道細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，魚(yú)類腸道中主要有致病桿菌屬Xenorhabdus、氣單胞菌屬Aeromonas、檸檬酸桿菌屬Citrobacter、假單胞桿菌屬Pseudomonas等。本研究中，采用PCRSSCP的分子技術(shù)鑒定方法研究了斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌多樣性，16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，以Zf1、Zf11為代表的菌株與已知種細(xì)菌Aeromonas veronii，Zf5與 Bacillus subtilis， Zf4、 Zf8與 Sphingomonas sp.，Zf7與Aeromonas sp.分別聚為一支，且16S rDNA序列一致性高達(dá)99%；同時(shí)從斑馬魚(yú)腸道中分離獲得Zf10菌株與uncultured bacterium clone一致性為92%，表明有可能為一種新分離菌株。斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌16S rDNA分子鑒定表明，Zf1、Zf7和Zf11屬于氣單胞菌屬Aeromonas，Zf4、Zf8屬于鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas，Zf5屬于芽孢桿菌屬Bacillus。此外，斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌Zf2、Zf3、Zf6、Zf9和Zf12等分離株構(gòu)建的陽(yáng)性克隆，測(cè)序尚未成功，這可能與魚(yú)類腸道細(xì)菌多樣性、菌株生物學(xué)特性和試驗(yàn)技術(shù)條件因素有關(guān)。已有研究報(bào)道，利用宏基因組技術(shù)可進(jìn)行微生物多樣性結(jié)構(gòu)和功能基因組研究[7]。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌16S rDNA的基因克隆測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)Zf10與尚未獲得純培養(yǎng)的菌株uncultured bacterium GI3-M-5-G01聚為一支，一致性為92%，推測(cè)菌株Zf10可能是一種新分離菌種，有待進(jìn)一步研究鑒定，以豐富斑馬魚(yú)腸道微生物物種資源。

3.2 魚(yú)類腸道細(xì)菌PCR-SSCP分析

有研究表明，16S rDNA序列分析在細(xì)菌鑒定方面具有不可替代的作用，結(jié)合SSCP技術(shù)可以提高檢測(cè)的特異性[9-10]。細(xì)菌16S rDNA既有保守區(qū)，也有相對(duì)變異區(qū)，因此，可以采用PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行鑒定分析[8]。王永等[9]對(duì)于4種食源性致病菌16S rDNA的可變區(qū)進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表明，4種致病菌16S rDNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性具有種屬特異性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，斑馬魚(yú)腸道分離菌種的SSCP圖譜無(wú)論從條帶的數(shù)目、相對(duì)遷移率及條帶之間的間距看，相互間均存在明顯差異，其中Zf1與Zf11帶型一致，Zf4與 Zf8帶型一致，而Zf5、Zf7、Zf10帶型各不相同，與前兩種帶型也有所不同。通過(guò)構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，其SSCP圖譜差異似與親緣關(guān)系成正比，即親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，差異越明顯。此外，16S rDNA基因V3區(qū)片段大小約為200 bp，利用SSCP分析V3區(qū)基因片段分辨率較高，得到的圖譜也較清晰；盡管如此，利用SSCP技術(shù)進(jìn)行分析時(shí)也有其缺陷，比如，當(dāng)分離片段較大 (＞400 bp)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)分辨率低、共遷移等現(xiàn)象[9，19]。此外，有學(xué)者利用PCR-DGGE、PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行腸道微生物、病原菌分析鑒定研究[19-20]。本研究中，斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)的PCR-SSCP結(jié)果與16S rDNA基因序列比對(duì)結(jié)果一致，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究中從斑馬魚(yú)腸道分離純化出的12株細(xì)菌，其中氣單胞菌屬Aeromonas等優(yōu)勢(shì)菌株與其他學(xué)者研究報(bào)道結(jié)果一致[15，18]，這為今后進(jìn)行斑馬魚(yú)腸道菌群及其微生態(tài)功能研究提供了科學(xué)依據(jù)，也為PCR-SSCP技術(shù)應(yīng)用于斑馬魚(yú)腸道細(xì)菌多樣性分析提供了參考。

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