新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒ORF39L基因克隆、表達(dá)及抗體的制備

張紅蓮， 夏立群， 秦啟偉

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學(xué)現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 湛江524088；3.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東深圳518108；4.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；5.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，廣東 廣州510301)

虹彩病毒 (grouper iridovirus，GIV)是一類侵染昆蟲(chóng)、爬行動(dòng)物、魚(yú)類等生物并能在宿主細(xì)胞質(zhì)形成包涵體的二十面體雙鏈DNA病毒[1]，因其病毒粒子在病毒感染的宿主體內(nèi)或在純化濃縮的病毒沉淀物中呈周期性間隔的異常整齊排列，形成晶格平面并互相重疊，當(dāng)有斜射光線照射時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色或紫色虹彩，故命名為虹彩病毒。隸屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬的新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒 (Singapore grouper iridovirus，SGIV)，是近年嚴(yán)重危害中國(guó)和東南亞國(guó)家石斑魚(yú)養(yǎng)殖的一種魚(yú)類傳染性病毒，該病毒能誘導(dǎo)石斑魚(yú)脾細(xì)胞以類凋亡這種無(wú)DNA片段化的程序性細(xì)胞死亡方式使患病魚(yú)脾臟腫大出血，致死率高達(dá)90%[2-4]。目前，學(xué)界已經(jīng)完成了關(guān)于SGIV的一些基礎(chǔ)研究工作，如病毒的分離鑒定、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和快速檢測(cè)方法等[5-8]。研究SGIV重要基因的功能，對(duì)探索該病毒感染的發(fā)生機(jī)制，制定病毒防控策略具有重要的意義。目前，對(duì)SGIV重要功能基因的研究已經(jīng)陸續(xù)在國(guó)內(nèi)外展開(kāi)[9-16]。

SGIV ORF39L是根據(jù)SGIV全基因組轉(zhuǎn)錄圖譜確定的晚期基因[7]，編碼一個(gè)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是虹彩病毒科核心基因[17]。核心基因所編碼的蛋白可以在宿主細(xì)胞內(nèi)廣泛地進(jìn)行復(fù)制和傳播，在病毒感染過(guò)程中具有重要作用。目前，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有對(duì)SGIV ORF39L基因功能的研究報(bào)道。為研究ORF39L在病毒侵染過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究中擬先制備ORF39L表達(dá)蛋白的抗體。ORF39L的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)3153 bp，編碼1051個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量為118.2 ku，序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，ORF39L基因結(jié)構(gòu)龐大，直接將其在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)有一定困難。為此，本研究中利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了ORF39L抗原表位基因片段，在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)，并將表達(dá)蛋白純化后制備抗體，利用抗體進(jìn)行了間接免疫熒光試驗(yàn)，旨在為進(jìn)一步研究ORF39L基因在SGIV感染過(guò)程中的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒 新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒 (SGIV)[2]和GS細(xì)胞[18](石斑魚(yú)脾細(xì)胞，grouper spleen cells)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院秦啟偉教授實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)和表達(dá)載體pET32a+購(gòu)自Novagen公司。

1.1.2 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)基

LB細(xì)菌培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH為7.2～7.4，15 g/L瓊脂，定容至1000 mL，高壓滅菌，4℃下保存。LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

GS細(xì)胞培養(yǎng)基：L15培養(yǎng)基 (Leibovitz's-15 GIBCO購(gòu)自Invitrogen公司)。

1.1.3 工具酶和試劑 PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Maker均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR片段純化、DNA凝膠回收及質(zhì)粒微量提取試劑盒均購(gòu)自Axygen公司；蛋白Maker購(gòu)自Fermentas公司；異丙基-B-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)購(gòu)自BBI公司；BCA-100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒和鎳瓊脂糖凝膠FF預(yù)成柱分別購(gòu)自上海申能博采公司和北京韋氏博慧色譜科技有限公司；His-Tag單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)-標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自Pierce公司；聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜購(gòu)自Millinpore公司。

提取病毒 DNA的堿裂解緩沖液：0.2 mol/L NaCO3， 0.3 mol/L NaCl， 0.02 mol/L EDTA。

1.1.4 免疫小鼠及相關(guān)試劑 免疫用6周齡雄性BALB/c小鼠，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。弗氏完全佐劑 (FCA)和弗式不完全(FIA)佐劑購(gòu)自Sigma公司。

PBS 溶 液： 8 g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，pH 7.4，用雙蒸水定容至1 L，高壓滅菌，室溫保存。

1.1.5 間接免疫熒光試驗(yàn)相關(guān)試劑 4%的多聚甲醛：稱取4 g多聚甲醛，溶于80 mL雙蒸水，逐步滴加1 moL/L NaOH(約2 mL)，邊加邊搖勻，待其全部溶解后，定容至100 mL，保存于棕色瓶中；異硫氰酸熒光素 (FITC)-羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)購(gòu)自美國(guó)Biotium公司；抗熒光淬滅封片劑購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析抗原表位基因 應(yīng)用DNA Star 5.0軟件分析SGIV VP39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親(疏)水性、柔韌性和表面可及性。采用Jameson-Wolf法分析VP39蛋白的抗原表位，并利用網(wǎng)站http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred在線分析VP39蛋白潛在的B細(xì)胞蛋白抗原表位。

1.2.2 SGIV總DNA的提取 總DNA的提取方法參考 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版 (上冊(cè))[19]。

1.2.3 SGIV ORF39L基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá) 根據(jù) SGIV(基因庫(kù)登錄號(hào)：AY521625)ORF39L(核苷酸的位置：34262-37417)的序列和質(zhì)粒pET32a+的MCS酶切位點(diǎn)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。

pET32a-39Ag1：

上游引物 5′GCCGAATTCATGGCTGATAATCTGAGC3′(EcoRI)；

下游引物 5′GCGCTCGAGTTATACTGGCCCTCCTAC3′(XhoI)。

pET32a-39Ag2：

上游引物 5′GCGGATCCATGGGAGGGCCAGTATATC 3′(BamHI)；

下游引物5′GCGAAGCTTGTTATCTGAACGCGGGTC 3′(HindⅢ)。

引物合成在上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

PCR循環(huán)反應(yīng)條件：95℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，52℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)；最后于72℃下再延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物純化回收，利用限制性核酸內(nèi)切酶分別酶切pET32a+質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物后，用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，次日熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定菌落PCR后，將陽(yáng)性克隆測(cè)序，從測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆中分別提取質(zhì)粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2，再次熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的BL21(DE3)涂布于LB平板上培養(yǎng)7～8 h，長(zhǎng)出的單菌落即為表達(dá)融合蛋白的原核重組菌BL21/pET32a-39Ag1和BL21/pET32a-39Ag2。挑取陽(yáng)性單菌落接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下以200 r/min震蕩培養(yǎng)8 h活化后，再按照1%(體積比)的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下以200 r/min震蕩培養(yǎng)至菌體濃度OD600nm值約為0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后取菌懸液1 mL，以10 000 r/min離心1 min收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。以上使用的LB平板和LB液體培養(yǎng)基均為含氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的選擇培養(yǎng)基。

1.2.4 融合蛋白的純化 參考夏立群等[20]方法。1.2.5 抗血清的制備 將純化好的融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑 (FCA)或弗氏不完全佐劑(FIA)混勻免疫BALB/c小鼠。取6周齡雄性BALB/c小鼠，每只小鼠每次皮下注射約30 μg純化的融合蛋白，首次注射液為蛋白與等體積完全佐劑 (FCA)混勻制備，之后3次注射液為蛋白與等體積弗氏不完全佐劑 (FIA)混勻制備。每隔7 d免疫注射1次，共4次。陰性對(duì)照注射液為佐劑加PBS，注射方法同上。末次免疫注射一周后，從小鼠眼球取血，4℃下過(guò)夜，次日離心分離血清，于-80℃下分裝保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定抗血清效價(jià)。

1.2.6 Western-blot蛋白印跡分析 利用誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌SDS-PAGE電泳進(jìn)行融合蛋白檢測(cè)。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，于4℃條件下，200 mA轉(zhuǎn)膜約80 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，用TBST(20 mmol/L Tris-HCl+150 mmol/L NaCl+0.05%Tween 20， pH 為7.4)漂洗 3次，每次 5 min。分別加入一抗(1∶5000稀釋的鼠抗 SGIV VP39Ab1血清或鼠抗SGIV VP39Ab2血清)，室溫下封閉孵育2 h，用TBST漂洗3次，每次5 min；再加入二抗 (HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶5000稀釋)，室溫下封閉孵育2 h，用TBST漂洗3次，每次5 min；最后加入DAB顯色液，避光顯色30～60 s，水洗終止反應(yīng)后，觀察顯色條帶，拍照保存，判斷制備的多克隆抗體特異性。利用SGIV感染的GS細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平檢測(cè)的Western-blot方法同上。

1.2.7 間接免疫熒光 (IFAT)試驗(yàn) 將GS細(xì)胞傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的無(wú)菌蓋片上。24 h后，接種約1 MOI(感染復(fù)數(shù))的SGIV。分別于感染12 h和24 h后，將蓋玻片從培養(yǎng)板中小心取出，以pH為7.4的PBS清洗細(xì)胞1次；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，以pH為7.4的PBS清洗細(xì)胞3次；用冰乙醇 (100%)透化7 min，用PBS清洗細(xì)胞2次。以2%牛血清白蛋白 (BSA)室溫下封閉1 h。用1∶75稀釋的抗SGIV VP39鼠血清作為一抗 (同時(shí)設(shè)以陰性血清為一抗的對(duì)照)，37℃下孵育細(xì)胞1 h，用PBS清洗細(xì)胞4次；用1∶75稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗，37℃下避光孵育細(xì)胞1 h，用 PBS清洗細(xì)胞3次；以 DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽) (用PBS稀釋至終濃度1 μg/mL)室溫下避光染核10 min，用PBS清洗細(xì)胞3次；再用抗熒光淬滅劑將蓋玻片的細(xì)胞面貼在載玻片上，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)測(cè)SGIV ORF39L抗原表位基因片段

橫軸為蛋白質(zhì)的氨基酸位置，縱軸為杰弗森-沃夫 (Jameson-Wolf)抗原指數(shù)。位于橫軸以上連續(xù)的峰值區(qū)間即為潛在的抗原表位，通過(guò)DNAStar軟件分析SGIV VP39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親 (疏)水性、柔韌性和表面可及性。從圖1可見(jiàn)，VP39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲從N末端到C末端均有分布，該蛋白的親水性、柔韌性和表面可及性區(qū)域較多。

SGIV VP39蛋白的抗原表位結(jié)果如圖2所示，其中，1～1050位氨基酸大部分肽段都可作為潛在的抗原。利用網(wǎng)站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred在線預(yù)測(cè)得到的SGIV VP39蛋白的抗原表位肽段有43個(gè)，分布位置和軟件分析的結(jié)果類似?；谝陨戏治?，選取N末端氨基酸的兩段基因序列39Ag1(1～414 bp)和39Ag2(402～783 bp)分別進(jìn)行克隆表達(dá)和制備抗體。

2.2 SGIV ORF39L抗原表位基因片段克隆

高保真PCR擴(kuò)增預(yù)測(cè)的SGIV ORF39L抗原表位基因39Ag1和39Ag2，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物結(jié)果。從圖3可見(jiàn)：在250～500 bp區(qū)間得到了39Ag1和39Ag2的目標(biāo)帶，與理論結(jié)果39Ag1為414 bp、39Ag2為381 bp大小相符合。證明擴(kuò)增目標(biāo)帶成功。切膠回收后，將其連接入pET32a+載體，陽(yáng)性克隆送到上海英駿公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Clustalx 1.83軟件與NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，插入基因片段序列正確，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2。

2.3 SGIV ORF39L的原核表達(dá)

將pET32a-39Ag1、pET32a-39Ag2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，分別以未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2的BL21(DE3)菌體作為陰性對(duì)照，與未融合重組菌全菌蛋白電泳條帶相比，在分子量約35 ku處均有一條超強(qiáng)蛋白帶的融合蛋白(圖4)，其中，VP 39Ag1蛋白的預(yù)計(jì)分子量約為15.79 ku，VP 39Ag2蛋白的分子量約為14.94 ku，pET32a+表達(dá)的融合標(biāo)簽為20.4 ku。與預(yù)期相符，說(shuō)明目的蛋白成功表達(dá)，對(duì)其分別命名為pET32a-VP39Ag1和 pET32a-VP39Ag2。

圖1 SGIV VP39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性及表面可及性圖Fig.1 Secondary structure， hydrophilicity， flexibility and surface accessibility of SGIV VP39 protein

圖2 SGIV VP39蛋白的抗原表位分析Fig.2 Analysis of the antigenic index of SGIV VP39 protein

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析39Ag1和39Ag2的PCR產(chǎn)物Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of 39Ag1 and 39Ag2 genes

2.4 融合蛋白的純化

用SDS-PAGE分析融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2純化的結(jié)果如圖5所示。純化的融合蛋白濃度用Bradford法測(cè)定，洗脫第一次、第二次和第三次收集液中純化的VP39Ag1融合蛋白濃度分別為 1140.07、 121.31、 11.45 μg/mL，純化的VP39Ag2融合蛋白濃度分別為1129.013、133.310、8.750 μg/mL。由此可見(jiàn)，純化蛋白濃度完全可以用于小鼠免疫。

2.5 Western-blot法檢測(cè)制備的多克隆抗體的特異性

ELISA法檢測(cè)表明，獲得的 VP39Ab1和VP39Ab2多克隆抗體效價(jià)均為1∶15 000。分別用純化的融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，用不同小鼠來(lái)源的免疫血清作為一抗分別進(jìn)行孵育，每只小鼠免疫血清孵育一條PVDF膜，Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分子量為35 ku附近有明顯的條帶 (圖6)，證明所制備的多克隆抗體39Ab1和39Ab2分別對(duì)融合蛋白 pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2有特異性。同時(shí)，本試驗(yàn)中用感染了SGIV病毒的GS細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了多克隆抗體39Ab1和39Ab2均能與分子量為118.2 ku的蛋白帶發(fā)生特異反應(yīng) (圖7)，說(shuō)明所制備多克隆抗體在細(xì)胞水平上可以檢測(cè)VP39蛋白。

圖4 VP39Ag1和VP39Ag2蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of VP39Ag1 andVP39Ag2 expressed in E.coli BL21

圖5 SDS-PAGE分析融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2純化的結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis of purification recombinant proteinspET32a-VP39Ag1 productand pET32a-VP39Ag2 product

圖6 Western-blot法分析抗血清39Ab1和39Ab2對(duì)融合蛋白pET32a-VP39Ag1 and pET32a-VP39Ag2的特異性Fig.6 Western-blot analysis of the specificity of antiserum 39Ab1 and 39Ab2 to the fusion protein pET32a-VP39Ag1 and pET32a-VP39Ag2

圖7 Western-blot法分析抗血清39Ab1和39Ab2對(duì)SGIV VP39蛋白的特異性Fig.7 Western-blot analysis of the specificity of antiserum 39Ab1 and 39Ab2 to SGIV VP39 protein

2.6 間接免疫熒光 (IFAT)試驗(yàn)

利用制備的VP39多克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，以確定VP39參與了SGIV在GS細(xì)胞中的裝配。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SGIV感染GS細(xì)胞12 h后，就可以在細(xì)胞中檢測(cè)到VP39的綠色熒光信號(hào)，且綠色熒光全細(xì)胞分布 (圖8)。而陰性對(duì)照細(xì)胞中則無(wú)綠色熒光出現(xiàn)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，感染24 h后，VP39分布在病毒裝配區(qū) (病毒加工廠)，說(shuō)明VP39參與了SGIV病毒的裝配過(guò)程。

圖8 間接免疫熒光檢測(cè)VP39在SGIV感染GS細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)Fig.8 Indirect Immunofluorescence detection of VP39 in SGIV-infected GS cells at different time

3 討論

本研究中主要著眼于SGIV ORF39L的原核表達(dá)、蛋白純化和抗體制備，以及抗體在免疫熒光試驗(yàn)中的應(yīng)用。鑒于ORF39L基因結(jié)構(gòu)龐大，直接在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)有一定的困難，為此，本試驗(yàn)中首先利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)SGIV ORF39L抗原表位基因片段，應(yīng)用DNA Star 5.0軟件子程序Protean分析了SGIV VP39蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及親 (疏)水性、柔韌性和表面可及性。其中，采 用 Kyte-Doolittle、 Karplus-Schultz、 Emini、Jameson-Wolf方法，分別預(yù)測(cè)氨基酸的親水性、氨基酸的柔韌性、氨基酸的表面可能性、潛在的B細(xì)胞抗原表位。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)各氨基酸殘基分為親水殘基和疏水殘基兩類[21]，疏水性殘基一般被埋在蛋白內(nèi)部，親水性殘基位于蛋白質(zhì)表面，親水性殘基與蛋白抗原表位有著密切的聯(lián)系。Hopp等[22]認(rèn)為，氨基酸序列中抗原表位存在的區(qū)域一般具有較強(qiáng)親水性；蛋白質(zhì)抗原構(gòu)象的多肽鏈骨架具有一定程度的柔韌性，柔韌性強(qiáng)的氨基酸殘基其可塑性大，從與抗體進(jìn)行嵌合的角度來(lái)說(shuō)，柔韌性高的氨基酸區(qū)域形成抗原表位的可能性較大一些[23]；表面可及性是指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，表面可及性參數(shù)高的氨基酸區(qū)域也更易于構(gòu)成抗原表位[24]。從VP39蛋白氨基酸序列的親水性、柔韌性和表面可及性方面分析 (圖1)，VP39蛋白具有多個(gè)抗原表位。采用Jameson-Wolf法和網(wǎng)站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred在線分析VP39蛋白潛在的B細(xì)胞蛋白抗原表位，也證實(shí)了DNA Star 5.0軟件分析的結(jié)果，考慮到抗原太小不利于后續(xù)的試驗(yàn)進(jìn)行，本試驗(yàn)中選取了比較大的兩個(gè)基因片段在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá)、蛋白純化和抗體制備，間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，依據(jù)抗原表位分析結(jié)果克隆、表達(dá)、免疫后制得的多克隆抗體，能在細(xì)胞水平上較好地檢測(cè)到VP39蛋白。

虹彩病毒在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中分別進(jìn)行了其生命周期中的不同復(fù)制，對(duì)于病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位研究可為其功能研究提供非常有用的參考。有研究表明[25-26]，虹彩病毒感染是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞方式進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)部分兩個(gè)階段 (細(xì)胞核階段和細(xì)胞質(zhì)階段)復(fù)制：在細(xì)胞核內(nèi)，病毒粒子以甲基化的病毒基因組DNA作模板，利用宿主細(xì)胞的II型RNA聚合酶和病毒早期基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)出病毒基因編碼的DNA聚合酶，再通過(guò)DNA聚合酶合成的病毒DNA，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開(kāi)始第二階段病毒基因組DNA的復(fù)制，形成了長(zhǎng)的DNA多聯(lián)體，最后加工切割成成熟的DNA，當(dāng)晚期基因轉(zhuǎn)錄并表達(dá)出病毒的結(jié)構(gòu)蛋白后，在細(xì)胞質(zhì)中完成病毒的組裝。成熟的病毒粒子會(huì)集中在細(xì)胞質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)病毒裝配區(qū) (viral assembly sites)，也稱為病毒加工廠(viral factory)的地方。在本試驗(yàn)中，SGIV感染晚期的GS細(xì)胞質(zhì)內(nèi)VP39在病毒裝配區(qū)處呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光，與病毒加工廠共定位，說(shuō)明VP39參與了SGIV的裝配，有可能是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白往往能夠作為病毒的抗原使用，因此，在研究病毒疫苗時(shí)應(yīng)將其作為重要的研究對(duì)象。

本研究中通過(guò)對(duì)SGIV ORF39L基因克隆表達(dá)和抗體的制備，為探索SGIV感染石斑魚(yú)的致病機(jī)理、開(kāi)發(fā)有效疫苗，以及防治虹彩病毒病害提供了科學(xué)依據(jù)。

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