△F508-CFTR在囊性纖維化治療中的研究近況及前景

楊紫嫣,孫瑩霄,董校汝,鄭 巖,李榮霞,張超可,李雨澎綜述,郝 峰審校*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，2.北華大學(xué)，吉林 吉林 132013)

囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)是一種常染色體隱性疾病[1]，同時(shí)也是一種致命性遺傳病，系由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突變造成。全球7萬多名CF患者中，白種人患病率最高[2]。同時(shí)根據(jù)各種臨床資料顯示，該病在我國也有一定的發(fā)病率。CF死亡率極高，和過去的幾十年相比較，盡管CF患者的壽命已經(jīng)有了明顯的延長，但是到目前為止并沒有發(fā)現(xiàn)完全安全及有效的治療方法。最近幾年，人們針對CFTR的結(jié)構(gòu)、功能、與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及其在CF治療中起到的作用這些方面都進(jìn)行了廣泛而深入的研究。

1 CFTR概述

1.1 CFTR結(jié)構(gòu)

CFTR氯離子通道蛋白是ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中一名成員，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)具有通道功能的家族成員[3-4]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，CFTR基因定位于人類的第7號常染色體長臂的q31-q32區(qū)上，CFTR基因全長為2.3×106bp，相對分子質(zhì)量為168 173，包含27個(gè)外顯子，通過核糖體編碼翻譯可以得到成熟的CFTR蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有1480個(gè)氨基酸殘基[5-7]。結(jié)構(gòu)上，CFTR有兩個(gè)跨膜區(qū)和兩個(gè)核苷酸結(jié)合域(nucleotide binding domains,NBDs)。每一個(gè)跨膜區(qū)含有6個(gè)跨膜的袢，這6個(gè)袢組成了氯離子通道。NBDs可以調(diào)節(jié)氯離子通道的開閉[8]?？缒^(qū)和NBDs是ABC超家族成員共同具有的特征。此外，CFTR還含有一個(gè)其他成員所沒有的特殊的調(diào)節(jié)區(qū)R，該調(diào)節(jié)區(qū)R含有蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和PKC所共有的磷酸化位點(diǎn)以及許多帶電氨基酸[9]。

1.2 CFTR氯離子通道的門控機(jī)制

CFTR主要通過兩個(gè)NBDs來調(diào)節(jié)氯離子通道的門控性[10]。每一個(gè)NBDs都包含有一個(gè)保守的磷酸結(jié)合環(huán)，該磷酸結(jié)合環(huán)也被稱為P環(huán)或者Walker A基序[11]，另外每一個(gè)NBDs還包含有保守的Walker B基序和LSGGQ基序。我們可以推測在腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的結(jié)合和水解方面，這些結(jié)構(gòu)域都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。打開CFTR氯離子通道需要ATP的結(jié)合，抑制氯離子通道的開放則需要ATP水解成ADP。兩個(gè)NBDs都含有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且都具有ATP酶的活性，可以實(shí)現(xiàn)水解ATP來調(diào)節(jié)通道的開閉[13-15]。據(jù)最新研究表明，當(dāng)NBD1和NBD2單獨(dú)存在時(shí)，氯離子通道處于關(guān)閉狀態(tài)。而當(dāng)NBD1和NBD2緊密結(jié)合形成一個(gè)牢固的二聚體之后，氯離子通道則處于開放狀態(tài)。而NBD1和NBD2這兩個(gè)NBDs形成的二聚體中，只有NBD2具有水解ATP的能力，使氯離子通道打開[16]。這種現(xiàn)象表明在細(xì)胞中NBD1和NBD2通過各自的機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對ATP水解以及門控的偶聯(lián)過程。此外CFTR氯離子通道還含有一個(gè)特殊的調(diào)節(jié)區(qū)域(R-domain)[17]，該調(diào)節(jié)區(qū)R含有豐富的磷酸化位點(diǎn)，可以用PKA和PKC使得CFTR磷酸化，并且根據(jù)磷酸化程度的差異來控制通道的活性[18]。

2 △F508-CFTR與CF

CFTR基因突變的種類有很多。通過研究CFTR相關(guān)患者，發(fā)現(xiàn)到目前為止已檢測出超過100種的CFTR氯離子通道突變類型。常見的類型有氨基酸刪除(delta-F508、delta-I507等)、氨基酸代替(錯(cuò)義突變)、蛋白質(zhì)合成提前終止(無義突變)和移碼突變。此外還有內(nèi)含子堿基突變影響外顯子拼接，比如第3、10、12、13、16、19、20個(gè)內(nèi)含子發(fā)生G-A突變。在上述的這些突變中，最常見的是CFTR蛋白第508位氨基酸缺失(ΔF508-CFTR)[21-22]。正常情況下，CFTR氯離子通道可以表達(dá)在細(xì)胞膜上，發(fā)揮氯離子通道的功能，將氯離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，同時(shí)水分子因滲透壓的作用也隨氯離子一起被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。而在病理情況下，CF患者體內(nèi)的CFTR功能出現(xiàn)異常，表達(dá)在細(xì)胞胞漿或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，無法表達(dá)在細(xì)胞膜上。這就導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈉離子、氯離子和水分子不能正常的排出細(xì)胞，使得細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度升高，細(xì)胞外水分減少，大量黏液滯留。若發(fā)生在呼吸道則容易形成栓塞，造成呼吸道的阻塞。并且大量黏液滯留在呼吸道，容易造成細(xì)菌的大量繁殖，引起呼吸道感染。感染部位聚集的中性粒細(xì)胞會釋放大量的蛋白酶，引起免疫介導(dǎo)的病變部位的炎癥反應(yīng)，長期呼吸道的感染與炎癥反應(yīng)最終會導(dǎo)致組織器官功能的衰竭[23]。ΔF508-CFTR這種突變的發(fā)生是由于蛋白發(fā)生了錯(cuò)誤的折疊或是由于與分子伴侶相互作用的過程發(fā)生障礙，使ΔF508-CFTR表達(dá)在胞漿中而無法轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上。而且即使加入corrector使得ΔF508-CFTR定位到頂膜上，CFTR仍然沒有氯離子通道的功能，還需要加入CFTR通道激活劑的作用才能使得CFTR恢復(fù)轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的功能[24]。所以篩選具有誘導(dǎo)ΔF508-CFTR蛋白質(zhì)重新上膜和恢復(fù)轉(zhuǎn)運(yùn)氯離子的小分子，對于治療CF具有重要意義[25]。

3 △F508-CFTR突變的治療

CF治療的傳統(tǒng)方法都只能是針對臨床癥狀的治療，但隨著CFTR基因的破譯，針對CFTR的基因療法給人們帶來了希望。已有不少研究發(fā)現(xiàn)許多藥物具有F508del校正器活性，其中包括4-苯基丁酸乙酯、米格魯特、西地那非、辛二?；Ｌ姹桨樊惲u肟酸、corr-4a、VRT-325、VRT-532等。但是由于該種藥物對于F508del突變的校正率低且選擇性差，因此也并沒有進(jìn)行更深入的研究及應(yīng)用[26]。嘌呤受體亞型P2Y2激活劑denufosol四鈉鹽(INS.37217),是一種由美國Inspire制藥公司研究開發(fā)的治療CF的藥物。該藥物可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氯離子和水的分泌，黏蛋白的釋放和纖毛擺動的頻率，同時(shí)還能增強(qiáng)體內(nèi)黏液的排除，與P2Y2受體的天然配體尿苷三磷酸具有相似的藥理作用[27]。該藥物對CF患者肺功能有明顯改善，同時(shí)安全性較高。目前本品在美國已進(jìn)入Ⅲ期臨床研究階段[28-29]。

Ivacaftor是由Vertex制藥開發(fā)，于2012年FDA批準(zhǔn)一種治療CF的新藥，其商品名為Kalydeco。該藥可以幫助6歲及以上患者有效改善攜帶罕見遺傳突變的CF患者的呼吸及肺部感染狀況。Ivacaftor是首個(gè)針對CF病因和有缺陷的CFTR蛋白的靶向治療藥物。Ivacaftor作為跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子CFTR的增效劑，通過作用于CFTR蛋白，延長該通道在細(xì)胞表面的開放時(shí)間，從而發(fā)揮治療作用[30]。但是，通過一系列研究表明，Ivacaftor僅對因G551D突變類型的CFTR有效，對△F508-CFTR突變類型無顯著效果。因此隨后Vertex公司又研發(fā)出Lumacaftor(VX-809)，該藥物對△F508-CFTR突變類型有較顯著的效果，并且該藥物還可以避免△F508-CFTR蛋白被降解。對該藥物進(jìn)行一系列的體外實(shí)驗(yàn)研究。研究結(jié)果表明：Lumacaftor具有較高的校正活性和選擇性，理論上可以用來進(jìn)行△F508-CFTR的校正，而且目前已經(jīng)進(jìn)行到臨床研究階段。通過一系列復(fù)雜的研究，2012年Vertex公司對外公布了關(guān)于Lumacaftor藥效研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從研究結(jié)果可以看出:使用Lumacaftor藥物治療的實(shí)驗(yàn)組中的受試者肺功能均較安慰劑對照組受試者的肺功能有較為明顯的改善。其中，當(dāng)Lumacaftor劑量為600 mg時(shí)，Lumacaftor與Ivacaftor連用之后對于肺功能改善效果最佳。

4 總結(jié)與展望

CF是引起缺陷或缺少CFTR蛋白活性的壽命限性疾病。隨著對CFTR的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)的研究以及對CFTR基因的破譯，為CF的治療帶來了個(gè)性化的改變。其中，聯(lián)合使用Lumacaftor和Ivacaftor兩種藥物的組合療法可以明顯改善CF患者的呼吸及肺部感染狀況,對于肺部CF患者的身體健康有很大的幫助。這種新型藥物組合療法僅在美國就可使得1.5萬名患者受益。由于聯(lián)合用藥能從多個(gè)方面改善缺陷CFTR的功能，給患者帶來的健康改善遠(yuǎn)大于單一藥物的作用效果，所以這也將是未來CF藥物研究的一個(gè)重要方向。

目前和未來的治療目標(biāo)主要集中在糾正CFTR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能異常方面。此外，一些改善癥狀的藥物也在使用中。例如，通過激活Ca2+敏感的氯離子通道，使細(xì)胞內(nèi)的氯離子和水分子排出細(xì)胞外，間接減輕了由于ΔF508-CFTR造成的呼吸道阻塞的臨床癥狀，達(dá)到改善癥狀的目的。

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