PES多孔細(xì)管對(duì)INS-1細(xì)胞和胰島在高糖環(huán)境下響應(yīng)能力影響的研究

傅韻潔,黃高平

(1 北京市第四中學(xué)，北京 100088；2北京市衛(wèi)生計(jì)劃生育委員會(huì)政策法規(guī)處，北京 100053)

0 引言

糖是一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)主要以葡萄糖和糖原的形式存在，主要由葡萄糖參與糖代謝。人體有其自發(fā)的糖代謝調(diào)控機(jī)制，當(dāng)血糖濃度降低時(shí)，人體中糖原降解以補(bǔ)充血糖；而當(dāng)血糖升高時(shí)，胰島素則被分泌并開始產(chǎn)生作用。當(dāng)人體中的糖代謝出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，體主便會(huì)罹患糖尿病。

糖尿病通常被分為I型糖尿病與II型糖尿病。I型糖尿病是由于胰島無(wú)法正常產(chǎn)生胰島素而導(dǎo)致，約占總數(shù)的10%左右。而II型糖尿病是由于胰島素?zé)o法參與糖代謝調(diào)節(jié)導(dǎo)致。

由于胰腺無(wú)法正常對(duì)血糖狀況進(jìn)行反饋并供給胰島素，I型糖尿病的治療相比II型糖尿病來(lái)說(shuō)更加困難。

糖尿病的治療方法主要有胰島素療法、激素替代法、胰腺移植以及胰島移植。胰島素的發(fā)現(xiàn)將原本迅速致命的疾病轉(zhuǎn)變?yōu)槁约膊。瑢?duì)糖尿病的治療帶來(lái)了極大的突破。隨后胰島素療法變?yōu)镮型糖尿病最普遍的療法。繼短效胰島素后，長(zhǎng)效胰島素的面世改善了許多病人的葡萄糖調(diào)控。但胰島素療法對(duì)于患者帶來(lái)終生的負(fù)擔(dān)和隨后長(zhǎng)期血糖控制能力的缺陷，以及糖尿病并發(fā)癥，仍然對(duì)患者的生活質(zhì)量造成重大影響。

在此之后的胰腺移植雖比不上長(zhǎng)效胰島素立竿見影，但是其生理反應(yīng)是持續(xù)性的。不過(guò)普遍認(rèn)為，胰腺移植面臨的最大問(wèn)題是宿主的免疫排斥。除非接受同卵雙胞胎活體胰腺供給的I型糖尿病患者不需要免疫抑制阻止排斥反應(yīng)外[1]，大多數(shù)胰腺移植要進(jìn)行免疫抑制誘導(dǎo)治療以及使用抑制劑來(lái)維護(hù)免疫抑制[2]。由于可用的人類胰腺限制和免疫抑制的必要性，相對(duì)整個(gè)糖尿病人口來(lái)說(shuō)只有極少數(shù)的人可以進(jìn)行胰腺移植。

胰島移植主要針對(duì)胰腺功能被部分削弱的患者，相較于整個(gè)胰腺的移植，胰島移植在技術(shù)方面更為容易且恢復(fù)更快，但患者仍然面臨著免疫抑制的風(fēng)險(xiǎn)。由于胰島體積較小，胰島移植作為細(xì)胞療法，在再生操做以及免疫隔離上有著更大的靈活性[3]。見圖1。

圖1 胰島移植圖解[4]

在細(xì)胞移植中，如果移植的細(xì)胞材料缺少必要的保護(hù)，便會(huì)被宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)攻擊，導(dǎo)致移植的細(xì)胞材料死亡，進(jìn)而導(dǎo)致移植失敗，甚至?xí)顾拗鳟a(chǎn)生較大的排斥反應(yīng)，造成宿主的痛苦。這種必要的保護(hù)即免疫隔離。

對(duì)于移植的細(xì)胞材料，為了避免免疫排斥，需要將其包裹起來(lái)，使其與免疫系統(tǒng)隔離。這種用于包裹細(xì)胞使其保持活性的裝置稱之為免疫隔離裝置。

常見的用于免疫隔離裝置的材料如表1：

表1 常見的用于免疫隔離的材料[5]

空心纖維是具有直徑范圍從50到3000微米[6]的管狀過(guò)濾膜。其幾何形狀賦予了它一系列的優(yōu)點(diǎn)，如緊湊性、優(yōu)良的傳質(zhì)性能和高耐外部靜流體壓力等[7]。在組織工程方面，空心纖維聚合物在細(xì)胞增殖和分化中充當(dāng)支架或支持以允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和清除的廢物高效通過(guò)[8]。聚醚砜（PES）是一種不可降解聚合物，作為生物相容性良好的生物材料，在組織工程中經(jīng)常被使用。目前在血管再生、神經(jīng)再生、生物反應(yīng)器、生物人工肝（BAL）、生物人工腎（BAK）方面均有應(yīng)用。

1 課題的提出

在引言中已經(jīng)提到，胰島移植作為I型糖尿病的一種較為有優(yōu)勢(shì)的治療方法，也有一定的造成免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，所以在移植時(shí)免疫隔離裝置必不可少。

除了一些必要因素外，細(xì)胞能否在裝置內(nèi)正常工作也是一個(gè)重要的考慮因素。希望選擇的免疫隔離裝置不會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常工作帶來(lái)太大的影響。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，提出了本課題的主要思路。

為了證明裝置適宜細(xì)胞在其內(nèi)工作，利用由四川大學(xué)膜科學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予的聚醚砜多孔細(xì)管設(shè)計(jì)微包囊結(jié)構(gòu)，以大鼠胰腺癌細(xì)胞和小鼠胰島作為研究對(duì)象，分別在普通培養(yǎng)皿和PES多孔管中進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)測(cè)試其在正常以及高糖環(huán)境下釋放胰島素的量來(lái)評(píng)估細(xì)胞在PES的多孔管免疫隔離裝置中的工作狀態(tài)。

此課題的研究結(jié)果將對(duì)以PES多孔管作為免疫隔離裝置進(jìn)行胰島的研究與應(yīng)用提供改進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，在一定程度上提高細(xì)胞移植的可行性和安全性。

2 材料及方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

實(shí)驗(yàn)所用主要試劑與品牌如下表所示。

試劑名稱 廠家杜氏磷酸緩沖液（DPBS）RPMI-1640培養(yǎng)基TrypLETMExpress胰酶胎牛血清（FBS）青霉素-鏈霉素丙酮酸鈉MEM alpha培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基Gibco(美國(guó))牛血清白蛋白-V 北京欣經(jīng)科二甲基甲酰胺（DMF）乙醇巰基乙醇北京化工廠硅膠 道康寧Histopaque 1077人淋巴細(xì)胞分離液 西格瑪膠原蛋白酶P 羅氏

2.1.2 儀器

生物安全柜(Thermo)，恒溫培養(yǎng)箱(Thermo），數(shù)顯恒溫水浴器(國(guó)華電器)，低速離心機(jī)(白洋），低溫冰箱(Thermo），液氮及容器(樂(lè)山東亞），細(xì)胞凍存盒（NalGene），細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精），移液槍 (Eppendorf），移液器(accu-jet Pro）。解剖用具（上海金環(huán)）（眼科剪，眼科鑷，動(dòng)脈止血夾（3cm），顯微止血夾(窄1.2mm），彎折的10mL注射器針頭)一次性靜脈輸液針(0.45x0.15)，蠟盤，體視鏡。

2.1.3 耗材

10cm 培養(yǎng)皿（Corning），2mL 細(xì)胞凍存管（Corning），1.5mL離心管（Axygen），5mL離心管（Axygen），15mL離心管（Corning），50mL 離心管（Corning），10 mL 移液管（Costar），移液槍頭（Axygen），微量注射器，1mL胰島素用注射器（BectonDickinson）。

2.1.4 胰島和細(xì)胞系

胰島取自C57BL/6雄性小鼠，細(xì)胞系為INS-1胰腺腫瘤細(xì)胞系。

2.1.5 PES多孔細(xì)管由四川大學(xué)膜科學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用微流控技術(shù)加工而成，內(nèi)徑為498μm，外徑為696μm，平均孔徑約為100nm。

2.2 方法

2.2.1 小鼠胰島的提取與純化

a）配消化液和終止液：

消化液0.5mg/mL（P型酶/HBSS緩沖液）現(xiàn)用現(xiàn)配。

終止液：15% FBS／HBSS緩沖液。

b）處死小鼠：斷頸法，并用彎折的10mL注射器針頭將其固定在蠟盤中。剪開腹腔，從小鼠體位的偏右側(cè)翻開腸子，找到膽總管。

c）灌注胰腺：用顯微止血夾將膽總管近肝端夾住，從近腸端的膨大處，利用靜脈輸液針向胰腺中灌注消化液（約2mL/只），至胰頭胰尾頭充盈即可。

d）分離胰腺：用兩把眼科鑷小心、快速的分離胰腺，并將分離的胰腺至于15mL離心管中。

e）靜置消化：37℃水浴鍋靜止消化17-18min左右。

f）終止消化：先向消化好的胰腺中加入2-3mL終止液，稍稍用力晃散胰腺，沒(méi)有大塊的組織即可；然后將終止液加到10mL以上混勻。

g）通過(guò)100目篩網(wǎng)，濾液收集到50mL離心管，再用5mL終止液潤(rùn)洗15mL離心管，沖洗篩網(wǎng)，減少胰島的丟失。

h）離心800RPM，2min，去上清，倒置離心管，置于吸水紙上，吸干剩余液體，將沉淀與5mL Histopaque 1077充分混勻，沿著內(nèi)壁均勻加入5mL Hanks液，分層明顯。

i）離心900g 20min，吸取中間胰島層，經(jīng)過(guò)倒置的100um濾網(wǎng)，使用5mL終止液將胰島從濾網(wǎng)上沖洗下來(lái)，分裝到兩個(gè)6cm的培養(yǎng)皿中。

j）在體視鏡下，手動(dòng)挑取胰島至含1-2mL HBSS液的3.5cm培養(yǎng)皿中，暫時(shí)不挑取的胰島置于冰上。

k）胰島培養(yǎng)：將純化好的胰島培養(yǎng)在3.5cm的培養(yǎng)皿中。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

INS-1完全培養(yǎng)基分為88%的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、10%的胎牛血清（FBS）、1%的Sodium、1%的青霉素-鏈霉素（P-S）和0.005%的巰基乙醇。胰島的培養(yǎng)基分為89%RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、10%的胎牛血清FBS、1%青霉素-鏈霉素（P-S），加葡萄糖調(diào)到濃度為7mmol。

細(xì)胞的復(fù)蘇過(guò)程中所用到的培養(yǎng)基需在水浴鍋中預(yù)熱準(zhǔn)備。

a）將處于-80℃液氮罐中凍存的細(xì)胞取出，在37℃水浴鍋中迅速振蕩解凍，以減少在解凍過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害。

b）將細(xì)胞（3mL）轉(zhuǎn)移至15mL 離心管。

c）將離心管置入離心機(jī)，配平后設(shè)置100rpm，5min離心。

d）取出離心管，棄上清，向離心管中加入2mL培養(yǎng)基，吹打，轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿。

e）用等量INS-1完全培養(yǎng)基稀釋，以減少凍存液對(duì)細(xì)胞的持續(xù)損害。

f）加入5mL INS-1培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，搖勻。

g）在培養(yǎng)皿邊緣記錄種類、代數(shù)、接種人、接種時(shí)間等信息。

h）將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中視其生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)先棄舊培養(yǎng)基，用2mL DPBS緩沖液輕輕沖洗培養(yǎng)皿底部，然后棄DPBS緩沖液，加入7mLINS-1完全培養(yǎng)基。

當(dāng)細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿底80%以上時(shí)，可以進(jìn)行傳代(傳代所需TrypLETMExpress、DPBS緩沖液、INS-1完全培養(yǎng)基均需提前預(yù)熱至37℃)。

傳代步驟如下：

a）棄培養(yǎng)基，加入2DPBS緩沖液清洗培養(yǎng)皿底部，清除死亡細(xì)胞。

b）加入2mL胰酶，搖動(dòng)培養(yǎng)皿使其鋪滿皿底，置于37℃恒溫箱中3min。

c）取出培養(yǎng)皿，加入2mLINS-1完全培養(yǎng)基中和，吹打使細(xì)胞完全懸浮，收集液體于15mL離心管中。

d）將離心管置于離心機(jī)中，設(shè)置100rpm，5min離心。

e）棄上清，加入2mL INS-1完全培養(yǎng)基，吹打均勻。

f）將液體均分至兩個(gè)皿中，每個(gè)皿添加INS-1完全培養(yǎng)基直至7mL。

g）在培養(yǎng)皿邊緣記錄種類、代數(shù)、接種人、接種時(shí)間等信息。

h）將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

當(dāng)無(wú)需繼續(xù)使用該種細(xì)胞時(shí)，可將細(xì)胞凍存，凍存液的配方為15%的DMSO與85%的胎牛血清混合，在使用時(shí)每1mL凍存液與0.5mL細(xì)胞懸液混合，混合后裝入細(xì)胞凍存管中，再封存至提前預(yù)熱至室溫的凍存盒中，放入-80℃冰箱中凍存，待凍結(jié)后轉(zhuǎn)入液氮罐中進(jìn)行凍存。

2.2.3 INS-1細(xì)胞和胰島的二維和三維培養(yǎng)

將INS-1細(xì)胞懸液吹打混勻，向每個(gè)6cm培養(yǎng)皿中加入4.5μL（相當(dāng)于每個(gè)多孔管細(xì)胞量的三倍）細(xì)胞懸液，加入3mL INS-1完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置入37℃恒溫箱培育。對(duì)于胰島：向每個(gè)6cm培養(yǎng)皿中加入150個(gè)胰島，加入3mL胰島培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿置入37℃恒溫箱培育。

將INS-1細(xì)胞置于75%乙醇中滅菌的PES多孔管取出，于DPBS緩沖液中反復(fù)漂洗。將細(xì)胞懸液吹打均勻，用微量注射器將1.5μL細(xì)胞懸液灌入多孔管，并用SILASTIC硅膠封閉兩端開口。將每3個(gè)裝置放入一個(gè)6cm培養(yǎng)皿中，加入3mL的INS-1完全培養(yǎng)基并置于37℃恒溫箱培育。

對(duì)于胰島：將置于75%乙醇中滅菌的PES多孔管取出，于DPBS緩沖液中反復(fù)漂洗。將細(xì)胞懸液吹打均勻，用微量注射器將150個(gè)胰島與培養(yǎng)基一起灌入多孔管，并用SILASTIC硅膠封閉兩端開口。將每3個(gè)裝置放入一個(gè)6cm培養(yǎng)皿中，加入3mL的胰島培養(yǎng)基并置于37℃恒溫箱培育。

2.2.4 胰島素體外分泌（GSIS）實(shí)驗(yàn)

a）取出培養(yǎng)INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基，加入2 DPBS緩沖液清洗培養(yǎng)皿底部，清除死亡細(xì)胞。

b）加入2mL胰酶，搖動(dòng)培養(yǎng)皿使其鋪滿皿底，置于37℃恒溫箱中3min。

c）取出培養(yǎng)皿，加入2mL INS-1完全培養(yǎng)基中和，吹打使細(xì)胞完全懸浮，收集液體于15mL離心管中。

d）將離心管置于離心機(jī)中，設(shè)置100 rpm，5min離心。

e）棄上清，每管分別加入1mL 含2.8mM葡萄糖的INS-1完全培養(yǎng)基，37℃孵育一小時(shí)，各自收集上清后將上清-20℃保存待測(cè)。

f）每管分別加入1mL 含16.7mM葡萄糖的INS-1完全培養(yǎng)基，37℃孵育一小時(shí)，各自收集上清后將上清-20℃保存待測(cè)。

g）每組管中各加入1mL的Hanks緩沖液漂洗細(xì)胞，待重新沉淀后小心吸盡緩沖液。

h）加入酸乙醇（乙醇、水、濃鹽酸以體積比為3：1：0.06 配比混合）1mL 裂解，-20℃保存待測(cè)。

對(duì)于胰島，除收集時(shí)不用胰酶消化＋離心收集而使用手動(dòng)吸取外，同以上操作。

2.2.5 INS-1分泌胰島素情況檢測(cè)

該部分由北京北方生物技術(shù)研究所完成。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 INS-1腫瘤細(xì)胞對(duì)高糖環(huán)境響應(yīng)情況

圖2 胰島素分泌曲線

由圖2可以看出，隨著葡萄糖濃度的提升，培養(yǎng)皿中的胰島素分泌下降，而PES多孔管中胰島素的分泌顯著上升。由此可以說(shuō)明，在PES管中胰腺癌細(xì)胞對(duì)于高糖的響應(yīng)是比較理想的；而對(duì)于在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞所出現(xiàn)的分泌下降的情況，可能是由于胰腺癌細(xì)胞分泌胰島素能力的低下、培養(yǎng)皿中細(xì)胞團(tuán)整體密度較大等原因造成。

3.2 胰島體外培養(yǎng)對(duì)葡萄糖的響應(yīng)性

圖3 放入培養(yǎng)皿和植入PES管的胰島對(duì)高糖的反應(yīng)性比對(duì)

由圖3可以看出，隨著葡萄糖濃度的提升，培養(yǎng)皿和PES多孔管中胰島素的分泌都呈上升趨勢(shì)，但在PES管中上升比在培養(yǎng)皿中的上升顯著得多。由此可以說(shuō)明，在PES管中胰島對(duì)于高糖的響應(yīng)是比較理想的。

4 討論

胰島腺移植作為Ⅰ型糖尿病根治手段之一，近年來(lái)也取得了許多進(jìn)展。絕大多數(shù)Ⅰ型糖尿病、無(wú)胰島素抗體和低水平C肽Ⅱ型糖尿病、糖尿病腎病、器官移植后糖尿病、胰腺疾病或胰腺切除導(dǎo)致的糖尿病等患者，適合進(jìn)行成人胰島細(xì)胞移植。

目前，胰島移植領(lǐng)域主要存在的問(wèn)題和困惑除了供體短缺外，移植物在宿主體內(nèi)難以長(zhǎng)期存活，患者不易獲得胰島素非依賴狀態(tài)；還包括免疫抑制現(xiàn)存的若干問(wèn)題：在無(wú)免疫抑制劑保護(hù)狀態(tài)下，移植胰島在宿主體內(nèi)可出現(xiàn)快速排異反應(yīng)，遭受免疫攻擊而失活。而長(zhǎng)期免疫抑制劑的應(yīng)用又是引起供體胰島進(jìn)行性功能衰竭、導(dǎo)致繼發(fā)失效的重要原因之一。

納米多孔復(fù)合膜能有效地阻隔免疫球蛋白及免疫細(xì)胞,但小分子物質(zhì)(如葡萄糖)能自由通過(guò)該膜,故該復(fù)合膜可以作為免疫隔離膜使用,并且具有良好的免疫隔離效果。

本文針對(duì)PES多孔管，對(duì)在裝置中的胰腺癌細(xì)胞血糖響應(yīng)進(jìn)行定性以及定量的分析。由圖2和圖3數(shù)據(jù)可知胰腺癌細(xì)胞和胰島細(xì)胞在PES多孔管中分泌胰島素的量隨著葡萄糖濃度升高而升高，展現(xiàn)出比較理想的情況，證實(shí)了胰島在PES多孔管中能較為正常地工作，腺癌細(xì)胞能像胰島細(xì)胞一樣在PES多孔管中仍然能較為正常地工作。

綜上，可以看出PES多孔管對(duì)胰島性質(zhì)細(xì)胞在高糖環(huán)境下的響應(yīng)沒(méi)有較大負(fù)面影響，能夠作為潛在的免疫隔離裝置，對(duì)于細(xì)胞移植有一定的價(jià)值，但其在胰島移植方面的改良和應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

INS細(xì)胞系和胰島細(xì)胞一樣具有很好的葡萄糖響應(yīng)性；植入PES的胰島對(duì)葡萄糖有很好的響應(yīng)性；PES管可以作為免疫隔離裝置應(yīng)用于胰島移植。

[1] Sutherland DE,Goetz FC,Sibley RK.Recurrence of disease in pancreas transplants[J].Diabetes,1989,38(suppl 1)：85-87.

[2] Stratta R J,Farney A C,Rogers J,et al. Immunosuppression for pancreas transplantation with an emphasis on antibody induction strategies： review and perspective[J]. Expert Review of Clinical Immunology,2014, 10(1)：117.

[3] Farney A C, Sutherland D E, Opara E C.Evolution of Islet Transplantation for the Last 30 Years[J].Pancreas,2016,45(1)：8.

[4] Serup P,Madsen O D,Mandrup-Poulsen T. Science,medicine, and the future： Islet and stem cell transplantation for treating diabetes[J].Bmj,2001, 322(7277)：29-32.

[5] O’Sullivan E S,Vegas A,Anderson D G,et al.Islets transplanted in immunoisolation devices：a review of the progress and the challenges that remain[J].Endocrine reviews,2011,32(6)：827.

[6] Baker R W.Membrane Technology and Applications[J].Metallurgical Transactions A,2004,6.

[7] Klein E.Hollow fiber membrane developments[J].Appl Polym Symp,1997,31：361-381.

[8] Diban N,Stamatialis D.Polymeric hollow fiber membranes for bioartificial organs and tissue engineering applications[J].Journal of Chemical Technology & Biotechnology,2014,89(5)：633-643.