農(nóng)作物種子轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR盲檢技術(shù)要點(diǎn)與應(yīng)用

辛 艷，劉 何，常雪艷，周 瑩

（天津市種子管理站，天津 300061）

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商品化推廣進(jìn)程加快，農(nóng)業(yè)部和各省市種子質(zhì)量監(jiān)管部門下達(dá)的抽查監(jiān)督檢驗(yàn)任務(wù)都要求進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測。因此，省級(jí)以上種子檢測機(jī)構(gòu)需要加快建立大批量農(nóng)作物種子樣品轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)平臺(tái)，為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物市場監(jiān)管提供技術(shù)保障。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測法已逐步列為農(nóng)業(yè)和出入境檢驗(yàn)檢疫部門的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并逐步成為各級(jí)轉(zhuǎn)基因檢測機(jī)構(gòu)重要方法。

1 TaqMan探針技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測方面應(yīng)用原理

TaqMan探針技術(shù)是美國Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實(shí)時(shí)PCR定量技術(shù)[1]。TaqMan探針技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測，是根據(jù)使用頻率最高的篩選基因即啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控元件或外源基因作為檢測靶標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，在對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過程中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀根據(jù)熒光信號(hào)的積累與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物形成同步的關(guān)系實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，再通過擴(kuò)增曲線對(duì)檢測模板DNA進(jìn)行定性分析，判定樣品中是否含有外源基因[2]。

2 TaqMan探針技術(shù)特點(diǎn)

TaqMan探針技術(shù)融匯了PCR靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜定量的準(zhǔn)確性，將熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)融為一體，具有特異性和準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈敏度高、假陽性低、重復(fù)性好、定量范圍寬、檢測效率高等特點(diǎn)。另外，實(shí)時(shí)定量PCR儀操作簡單、安全、自動(dòng)化程度高，PCR擴(kuò)增和檢測在全封閉的同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，能有效減少核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，而且擴(kuò)增和檢測一步完成，不需要電泳等PCR后期處理，更避免了電泳染色劑EB、放射性同位素或揮發(fā)性有害物質(zhì)如甲醛等對(duì)檢測人員的傷害[3]。

目前，我國針對(duì)已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品種中使用頻率最高的調(diào)控元件，如啟動(dòng)子CaMV35S、終止子NOS及通用于多種主要農(nóng)作物的抗蟲基因Cry1Ab/c、耐除草劑基因EPSPS等，設(shè)計(jì)出30多對(duì)特異性引物和相應(yīng)的熒光探針，陸續(xù)建立了多種農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該方法可快速準(zhǔn)確地檢測出國內(nèi)外主要商品化轉(zhuǎn)基因品種，涉及主要農(nóng)作物包括玉米、大豆、水稻、油菜、棉花等。表1是出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中轉(zhuǎn)基因作物的主要篩選基因[2，4-7]。

表1 出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中玉米、大豆、水稻、油菜、棉花的篩選基因

3 TaqMan探針技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因成分技術(shù)流程與操作要點(diǎn)

3.1 樣品預(yù)處理

檢測樣品前要充分混勻，根據(jù)樣品特性選擇研磨方式。淀粉類種子如玉米種子取20粒，水稻種子30～40粒，直接用球磨儀或組織研磨儀研磨；含油成分較高的如棉花、油菜等可在研磨的樣品中加入1 mg左右的硼砂，防止樣品在研磨中粘在一起。還可將種子培養(yǎng)至發(fā)芽，取發(fā)芽的第一葉部分用液氮研磨。

樣品的預(yù)處理過程中應(yīng)注意研磨罐或研磨坩堝及取樣器具每用一次必須清潔干凈且干燥，確保無任何污染、樣品間的機(jī)械混雜及樣品組分的改變。

3.2 DNA提取及其質(zhì)量測定

選擇CTAB法、SDS法、試劑盒法都是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的DNA提取方法。對(duì)于大批量農(nóng)作物種子樣品，既要在有限時(shí)間內(nèi)完成任務(wù)又要保證DNA提取質(zhì)量，采用DNA提取試劑盒法是符合要求的好方法。該方法污染較少，效率高，提取濃度在20～100 ng·μL-1，3 h內(nèi)可提取20～30個(gè)樣品的DNA。CTAB法和SDS法可獲取較高濃度的DNA，但這兩種方法提取時(shí)間長，效率低，易污染，且要用到易揮發(fā)的有毒試劑，不適合大批量樣品提取。

DNA質(zhì)量的檢測可以用瓊脂糖凝膠電泳法、紫外分光光度計(jì)和超微量紫外分光光度計(jì)來測定。高質(zhì)量的DNA在瓊脂糖凝膠電泳上顯示的是清楚明亮的單一條帶，如果出現(xiàn)彌散拖尾的條帶則說明DNA質(zhì)量不好或有降解。使用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度和純度，比用瓊脂糖凝膠電泳法更加便利，迅速，檢測結(jié)果直觀。稀釋部分DNA，測定并記錄其在260 nm和280 nm的紫外吸收率。以一個(gè)OD260相當(dāng)于50 μg·mL-1DNA濃度來計(jì)算DNA濃度。以O(shè)D260/280值表示DNA樣品純度。OD260/280值在1.7～2.0說明DNA純度較好；若OD260/280值小于1.7可能有蛋白質(zhì)殘留，也可能是用去離子水洗脫的原因；若OD260/280值大于2.0，可能有RNA污染或DNA降解。

3.3 平行樣與對(duì)照的設(shè)置

檢測樣品設(shè)2個(gè)平行樣；每次檢測必須設(shè)立3個(gè)對(duì)照，一是陽性目標(biāo)DNA對(duì)照，為可溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取的DNA；二是陰性目標(biāo)DNA對(duì)照，為非轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物樣品DNA；三是試劑空白對(duì)照（不含DNA模板）。同時(shí)檢測內(nèi)源基因，每次檢測要設(shè)立3次重復(fù)。

3.4 檢測流程

轉(zhuǎn)基因成分的檢測對(duì)象包含啟動(dòng)子、終止子、外源目的基因或標(biāo)記基因事件。對(duì)大批量種子樣品的轉(zhuǎn)基因成分定性檢測，先進(jìn)行啟動(dòng)子和終止子的篩查，篩查結(jié)果為陽性的樣品再進(jìn)行功能基因或標(biāo)記基因的篩查。例如，轉(zhuǎn)基因玉米的定性篩查，只要檢測啟動(dòng)子P-CaMV35S，終止子T-NOS，篩查率就可達(dá)99%?？紤]到功能基因的分布，加上 BAR、PAT、NPTII、Cry1Ab/c、gat等元件，轉(zhuǎn)基因玉米的檢測覆蓋率可達(dá)2次以上，大大降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)。

3.5 引物和探針濃度要求

引物和探針的濃度影響反應(yīng)的特異性。引物和熒光探針按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)公布的序列購置，按照產(chǎn)品說明用TB緩沖液或去離子雙蒸水配制成100 μmol·L-1母液保存于-20 ℃，應(yīng)用時(shí)引物配制成10～20 μmol·L-1工作液，探針配制成5～10 μmol·L-1工作液。熒光PCR反應(yīng)的引物終濃度為0.1～0.6 μmol·L-1，探針終濃度為0.05～0.30 μmol·L-1。體系中引物與探針濃度低會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不完全，濃度高則會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。

3.6 熒光PCR緩沖液的要求

熒光PCR反應(yīng)最好使用市售的專用qPCR混合液。一般專用qPCR混合液是2倍濃度；熒光PCR反應(yīng)體系要求的終濃度為1倍。如果自行配制qPCR體系混合液，25 μL體系中，PCR緩沖液終濃度為1倍，dNTP終濃度為0.2 mmol·L-1，濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低，進(jìn)而影響Taq酶發(fā)揮最佳活性；Mg2+終濃度為2.5 mmol·L-1，Mg2+的濃度高會(huì)增加非特異性擴(kuò)增；Taq酶終濃度為2.5 U,濃度高也可引起非特異性擴(kuò)增，濃度低則合成產(chǎn)物量減少。

3.7 模板DNA濃度

模板DNA的質(zhì)量會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效率。最初提取較高濃度的DNA母液應(yīng)在-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。稀釋部分DNA，以濃度20～50 ng·μL-1作為工作液分管保存，用TE緩沖液溶解和稀釋模板DNA能延長保質(zhì)期。在25 μL體系中，模板DNA濃度在20～50 ng·μL-1下，取2.0～4.0 μL均可擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物。

3.8 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的條件設(shè)置

轉(zhuǎn)基因篩選實(shí)時(shí)熒光PCR的參數(shù)設(shè)置條件依儀器不同稍有改變，一般為50 ℃ 2 min，95℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。引物與探針的退火溫度極其重要。一般探針的退火溫度（Tm值）比引物高10 ℃。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，適宜的退火溫度為55～60 ℃，以確保引物在延伸時(shí)探針保持與目標(biāo)序列的結(jié)合。轉(zhuǎn)基因篩選實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)一般設(shè)置為25～40個(gè)循環(huán)。只有極微量的待測樣本，適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)以提高反應(yīng)的檢出底限，可以將循環(huán)數(shù)增加至45。實(shí)際上，當(dāng)循環(huán)數(shù)增加到某一值時(shí)，反應(yīng)曲線趨于平線，不再升高。

3.9 實(shí)時(shí)熒光PCR儀操作要點(diǎn)

3.9.1 反應(yīng)板的設(shè)置

3.9.2 上樣操作

3.1 0 實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果分析

實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果的判斷首先要設(shè)置無效基線范圍?；€范圍選擇在3～15個(gè)循環(huán)，與熒光通道無關(guān)。人為設(shè)置的熒光信號(hào)閾值（Ct值），原則上要大于樣本的熒光背景值和陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高值，同時(shí)盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段。農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因成分檢測Ct值為一般以40為準(zhǔn)。

內(nèi)源基因的檢測是可以驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系中是否存在抑制物質(zhì)，以避免檢測結(jié)果的假陽性。不同農(nóng)作物實(shí)時(shí)熒光PCR方法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)源基因檢測Ct值規(guī)定不同。以轉(zhuǎn)基因玉米檢測為例，內(nèi)源基因檢測的臨界值為24。內(nèi)源基因檢測Ct值均小于或等于24時(shí)，當(dāng)設(shè)置的陰性與空白對(duì)照結(jié)果正常情況下，待測樣品每個(gè)重復(fù)檢測的Ct值均小于或等于36，判定該樣品檢出外源基因；待測樣品各重復(fù)的Ct值大于或等于40，判定該樣品未檢出外源基因；如果待測樣品各重復(fù)的檢測Ct值在36～40之間，需要重做，并考慮調(diào)整模板DNA加入量。再次擴(kuò)增后在設(shè)置的各對(duì)照結(jié)果均正常情況下，待檢樣品Ct檢測值仍小于40，則可判定該樣品檢出外源基因；Ct檢測值大于40，則可判定該樣品未檢出外源基因[4]。

Ct值的大小還與模板DNA的濃度相關(guān)。適宜的DNA模板量是內(nèi)源基因檢測的Ct值在15～36之間，外源基因的檢測Ct值在27～36之間。Ct值小于15時(shí)，應(yīng)減少模板DNA量；而Ct值超過40時(shí)，表明PCR過程中沒有目標(biāo)DNA擴(kuò)增；在Ct值在36～40之間時(shí)，且各平行樣的檢測結(jié)果差異很大，說明模板DNA在PCR反應(yīng)體系中的含量很少，需要增加模板量或提高模板DNA濃度[4]。

4 多重?zé)晒釶CR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因元件篩查方面的探索

多重?zé)晒釶CR是對(duì)多個(gè)（1個(gè)以上）目的基因同時(shí)做熒光PCR檢測。設(shè)計(jì)多重?zé)晒釶CR要考慮五個(gè)因素， 一是特異性引物和探針的組合要求。所設(shè)計(jì)的引物退火溫度Tm值接近相同（55～60 ℃），相應(yīng)的探針的Tm值接近相同，約高于引物Tm值5～10 ℃，且不同引物及探針之間不能互補(bǔ)。建議用Beacon Designer、Primer Premier 5.0或 Oligo 6.72 軟件設(shè)計(jì)多重反應(yīng)的引物與探針組合；二是多重?zé)晒釶CR實(shí)驗(yàn)要求使用多個(gè)報(bào)告基團(tuán)來追蹤每個(gè)靶標(biāo)的擴(kuò)增反應(yīng)，為區(qū)分每個(gè)反應(yīng)，應(yīng)選擇發(fā)射波長最小限度重疊的熒光報(bào)告基團(tuán)；三是多重?zé)晒釶CR反應(yīng)要求的模板DNA的濃度和純度較高，濃度要求在150～300 ng·uL-1,純度要求在1.8～2.0之間。普通DNA提取試劑盒所提取的DNA達(dá)不到要求，使用改良的CTAB[8]法會(huì)得到較高濃度和純度的DNA；四是多重?zé)晒釶CR體系最好專用qPCR混合液，因?yàn)槠渚彌_液、DNA聚合酶及dNTP的配比良好，還具有PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑，可以提高反應(yīng)效率。五是建立多重實(shí)驗(yàn)的先要優(yōu)化單重引物/探針反應(yīng)，使其擴(kuò)增效率達(dá)到90%以上；然后在同一反應(yīng)板上進(jìn)行靶序列的單重和多重試驗(yàn)，如果單重與多重的靶序列Ct值差異不明顯，則說明體系中各成分加量合適，反之則需要優(yōu)化反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)預(yù)混液、引物/探針、模板DNA的加入量來實(shí)現(xiàn)。

多重?zé)晒釶CR技術(shù)在病原菌檢測、病毒檢測方面的應(yīng)用報(bào)道較多，在轉(zhuǎn)基因成分定性與定量檢測方面的報(bào)道還不多。董進(jìn)法[9]設(shè)計(jì)了P-35S和T-NOS多重?zé)晒釶CR體系，成功將轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆分開；劉光明等[10]也設(shè)計(jì)出了35S啟動(dòng)子和NOS終止子的雙重特異性引物，利用多重?zé)晒釶CR同時(shí)檢測了大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等11份樣品中的CaMV35S和NOS轉(zhuǎn)基因成分。付偉等[11]針對(duì)大豆內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系的5’端插入序列設(shè)計(jì)特異性引物及探針，建立了同時(shí)檢測大豆內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系的雙重?zé)晒舛縋CR方法并運(yùn)用于15種轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的特異性評(píng)價(jià)，其靈敏度達(dá)到0.01%。可見實(shí)時(shí)熒光多重PCR在轉(zhuǎn)基因定性與定量方面值得進(jìn)一步研究和推廣。

5 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)展望

利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法對(duì)大量盲樣進(jìn)行篩查，既提高檢測效率，又降低檢測成本，而且準(zhǔn)確性高，該方法可廣泛用于農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督抽查大批量盲樣的轉(zhuǎn)基因成分檢測。但越來越多的轉(zhuǎn)基因作物采用全新的啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因，利用已公布的引物和探針做檢測就會(huì)有一定的局限性，這就需要不斷開發(fā)新型的特異性引物和熒光探針，將來轉(zhuǎn)基因成分篩查基因也會(huì)更多。若該技術(shù)與生物芯片、免疫磁珠、色譜技術(shù)、光譜技術(shù)和微解剖技術(shù)[12]等各類技術(shù)聯(lián)合開發(fā)使用，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測方面的應(yīng)用前景必將越來越廣闊。

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[4]中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T1196—2012 轉(zhuǎn)基因成分檢測 玉米檢測方法[S].

[5]中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T1197—2016 油菜中轉(zhuǎn)基因成分 普通PCR法和實(shí)時(shí)熒光檢測方法[S].

[6]中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T1199—2010棉花中轉(zhuǎn)基因成分定性檢測方法[S].

[7]中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T 1195-2003 大豆中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測方法[S].

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