干旱條件下DCMU對高表達轉C4-pepc水稻的花青素合成基因及其相關信號的影響*

何亞飛, 許夢潔, 李 霞

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干旱條件下DCMU對高表達轉C4水稻的花青素合成基因及其相關信號的影響*

何亞飛1,2, 許夢潔1,3, 李 霞1**

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質水稻工程技術研究中心/國家水稻改良中心南京分中心 南京 210014; 2. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院 南京 210037; 3. 南京曉莊學院 南京 211171)

為了揭示高表達轉玉米C4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC, EC 4.1.1.31)基因水稻(PC)在耐旱中光合與花青素調節(jié)途徑的內(nèi)在聯(lián)系, 本研究以PC和未轉基因野生型原種(WT)的水培苗為試驗材料, 在4~5葉期, 通過50 μmol?L-1光合抑制劑DCMU[3-(3’,4’-dich-lorophenyl)-1,1-dimethyl-urea]預處理1 h, 觀察其在12% PEG-6000模擬干旱處理下的表現(xiàn)。結果表明, 在模擬干旱條件下, DCMU預處理使兩種供試材料相對含水量顯著下降, 且PC相對含量顯著高于WT; 干旱處理下, 兩種材料的花青素含量顯著升高, DCMU和干旱處理使兩種材料的花青素含量下調, 且PC水稻中始終伴隨著較高的花青素含量。光合數(shù)據(jù)表明, 與單獨12% PEG-6000處理相比, DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理顯著抑制了兩種水稻材料的凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2含量及羧化效率, 但PC的各指標顯著高于WT。同時, DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理顯著下調兩種供試材料的內(nèi)源蔗糖含量, 但PC中蔗糖含量顯著高于WT。進一步研究發(fā)現(xiàn)PC中更高的蔗糖含量與花青素合成有關轉錄因子(,)、()、(constitutively photomorphogenic 1)、(elongated hypocotyl 5)更高的轉錄水平同步, 下游花青素合成相關基因、、、、’、、的表達量增加。PC水稻可能通過誘導NO和Ca2+感受干旱信號, 參與轉錄因子的調節(jié), 進而參與花青素合成基因的調控, 合成較多的花青素, 增強PC水稻對干旱逆境的響應, 增強保水能力, 最終表現(xiàn)耐旱。

轉C4基因水稻; 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶; 蔗糖; 花青素; DCMU; 干旱

水稻(L.)是世界上重要的糧食作物之一。而干旱嚴重制約著水稻的生長和發(fā)育, 降低其產(chǎn)量[1]。近年來全球干旱呈加重趨勢, 從多角度解析水稻的耐旱機理成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物學研究的熱點之一。C4植物如玉米(L.)在干旱等逆境條件下表現(xiàn)較高的光合效率和水分利用率, 進而表現(xiàn)一定的抗逆性[2]。因此, 科學家們一直希望將C4植物中的關鍵基因轉入C3植物水稻中, 提高水稻光合效率和耐逆性, 增加產(chǎn)量[3]。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)是C4植物光合途徑中的關鍵酶。PEPC不僅在提高C4光合效率中起關鍵作用, 在耐旱性方面也扮演著重要的角色[4]?，F(xiàn)已通過基因工程技術獲得高表達轉玉米C4-基因水稻(PC)[5-6]。眾多研究表明PC水稻不僅表現(xiàn)出較強的光合能力和較高的產(chǎn)量[7-10], 而且表現(xiàn)耐旱以及耐低氮特性[11-15]。

PEPC參與植物光合作用中的碳固定以及三羧酸循環(huán)中的碳回補功能, 大量研究發(fā)現(xiàn)在各種生物脅迫和非生物脅迫下PEPC活性增加, 這有可能來源于基因的轉錄水平、蛋白質合成或蛋白質磷酸化水平的增加[16]。轉玉米C4型基因水稻在光氧化、高溫和干旱脅迫下具有相對較高的光合速率, 葉綠素含量和成分衰減緩慢, 活性氧產(chǎn)生速率較低, PSⅡ活性較穩(wěn)定, 表現(xiàn)出耐光氧化的特性[7-8,17-20]。近年來的研究表明: 干旱脅迫誘導PC引發(fā)多種信號轉導機制, 如Ca2+(calcium ion)、H2O2(hydrogen peroxide)、NO(nitric oxide)和ATP(adenosine triphosphate)信號等[10,21-24], 而且PC能夠通過下游依賴性的蛋白激酶調控相關基因包括干旱誘導轉錄因子基因、以及干旱誘導蛋白激酶基因、、、和等[19-24]。干旱脅迫能夠快速誘導水稻干旱相關轉錄因子和蛋白激酶表達, 通過調控抗旱基因表達, 磷酸化和去磷酸化調控機制, 響應干旱脅迫[25]。

光合產(chǎn)物的運輸與分配對植物體的生長發(fā)育具有重要的作用, 是決定作物生長發(fā)育的重要生理過程。之前的研究證實在C3植物葉肉細胞中具有C4微循環(huán)的運轉, 并且C3植物水稻中PEPC是C4微循環(huán)中的限速酶[26]。而二氯苯基二甲基脲[3-(3’,4’-dich-lorophenyl)-1,1-dimethyl-urea, DCMU]是一種除草劑(敵草隆), 也是一種電子傳遞抑制劑, 可以阻斷類囊體膜上的電子傳遞, 從而抑制光合作用。它抑制從PSⅡ上的Q向PQ的電子傳遞, 從而可能抑制碳水化合物的累積。由于C4途徑比C3途徑要消耗更多的能量, DCMU可以結合在光反應中心D1蛋白的QB位點上, 阻止QB的還原, 從而阻斷電子傳遞, 進而抑制光合作用[27-28]。

眾所周知, 蔗糖不僅作為光合產(chǎn)物的主要形式, 而且在逆境條件下植物通過光合作用合成的碳更容易向次生代謝物轉化, 其中花青素是重要的抗氧化分子, 有助于保護植物免受ROS(reactive oxygen species)的損害[29]。在許多植物物種中, 尤其是在逆境條件下, 花青素的積累受糖(sugar)和光信號傳導正調節(jié)。如蔗糖(sucrose, Suc)是擬南芥[(L.) Heynh.]幼苗中花青素生物合成最有效的誘導劑, 其他糖和滲透物質效果較差或無效[30]。在擬南芥中Suc特異性信號通路可進一步刺激果聚糖和花青素的產(chǎn)生, 而且Suc特異地誘導花青素生物合成需要MYB75/PAP1等轉錄因子基因的參與[31], MYB型轉錄因子在其生物合成中具有中心作用且其還嚴格依賴于Ca2+[29]; 小麥R2R3-MYB蛋白PURPLE PLANT1(TaPL1)作為花青素生物合成的正調節(jié)子, 參與花青素的合成[32]。已有研究表明SnRK激酶能夠通過感知Ca2+、NO和ABA等信號激活, 從而通過MYB等轉錄因子調節(jié)花青素的合成[29,31,33-34]。但在水稻中糖是否誘導花青素生物合成以及參與信號的調節(jié)機制還不明確。但我們可以從高表達轉玉米C4-水稻前期研究中獲得一些線索, 如本文之前的研究已經(jīng)表明該材料耐旱, 且在PEG 6000模擬干旱處理下, PC水稻中Suc含量顯著被上調; 此外, 本實驗室之前在植株水平和細胞水平均證實其耐旱的響應過程依賴于細胞內(nèi)的鈣離子[22-23]。本研究選取干旱耐性以及光合能力差異明顯的高表達轉玉米C4-基因水稻(PC)和未轉基因的野生型水稻(WT)為材料, 在供試材料的4~5葉期, 采用50 μmol?L-1DCMU根吸入預處理1 h, 并采用12% PEG-6000對稻苗進行模擬干旱處理, 解析光合、糖和花青素參與PC水稻的干旱響應, 探究碳水化合物的積累和花青素合成之間的聯(lián)系, 從而解析高光效和抗逆之間的協(xié)調關系, 期望更多地了解C4-在水稻中緩解干旱脅迫的生理功能, 為“C4稻”在干旱中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗以高表達轉玉米C4-基因水稻(PC)[5]和野生型水稻‘Kitaake’(WT)為試驗材料。所選材料種子首先用75%的酒精洗滌浸泡5 min, 然后用50%次氯酸鈉溶液浸種消毒15 min, 隨后用蒸餾水反復沖洗數(shù)次直至無次氯酸鈉殘留。將種子置于30 ℃、黑暗條件下4 d, 然后使用國際水稻研究所(International Rice Research Institute)營養(yǎng)液配方進行培養(yǎng)[35]。待水稻長到5~6葉期, 于晴天傍晚選擇株型、長勢、葉片均一的植株進行處理, 并統(tǒng)一測定生理指標。

1.2 DCMU預處理和模擬干旱脅迫處理

參照Qian等[22]的方法, 將所有植株分3組, 每組30株, 重復3次: 一組加入等量含50 μmol?L-1光合電子傳遞抑制劑DCMU溶液的營養(yǎng)液, 預處理1 h, 再加入含12% PEG-6000的營養(yǎng)液處理2 h; 一組加入營養(yǎng)液, 再加入含12% PEG-6000的營養(yǎng)液處理2 h; 另一組只加入營養(yǎng)液。在處理結束選取后, 隨機選取5株的倒2葉, 快速進行樣品采集, 用液氮速凍后, 立即置于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 光合參數(shù)的測定

參照Li等[36]的方法, 采用美國 LI-COR 公司生產(chǎn)的LI-6400便攜式光合測定儀, 利用儀器自帶的紅藍光源, 大氣CO2濃度400 μmol?mol-1, 光量子通量密度(photosynthetic photon quanta flux density, PPFD)800 μmol?m-2?s-1, 流速設定為500 μmol?s-1, 葉室溫度設置為25 ℃。室內(nèi)溫度控制在25~30 ℃, 在各處理結束時取植株的倒2葉, 測定其凈光合速率(net photosynthesis rate,n)、氣孔導度(stomatal conductance,s)、胞間 CO2濃度(intercellular CO2concentration,i)及羧化效率(carboxylation efficiency, CE)等指標, 每個處理30株, 每次隨機選擇測量4次, 重復3~5次。

1.4 葉片相對含水量(relative water content, RWC)的測定

使用打孔器在供試材料倒2葉的中間1/3處打取直徑為0.5 cm的葉圓片10片, 稱其鮮重(fresh weight, FW); 然后將葉圓片懸浮于裝有蒸餾水的培養(yǎng)皿中, 4 ℃黑暗下處理18 h, 稱飽和鮮重(turgid fresh weight, TW), 最后將葉圓片于105 ℃殺青15 min, 然后置于75 ℃下烘至恒重。最后用千分之一天平稱其干重(dry weight, DW)。相對含水量(relative water content, RWC)按照如下公式計算: RWC(%)=(FW–DW)/(TW–DW)×100%。

1.5 可溶性糖及各糖組分含量的測定

糖組分和含量測定參照Ambavaram等[37]的方法進行?？扇苄蕴?、蔗糖、葡萄糖、果糖含量分別在620 nm、290 nm、505 nm和285 nm測定吸光值。

1.6 花青素含量的測定

花青素含量的測定參照Rabino等[38]的方法進行, 分別在530 nm、657 nm處測定吸光值, 花青素含量的計算則通過A530-A657計算。

1.7 一氧化氮(NO)含量的測定

水稻葉片NO濃度的測定參照Murphy等[39]的方法。

1.8 過氧化氫(H2O2)含量的測定

水稻葉片H2O2濃度的測定參照Ren等[10]的方法。

1.9 鈣離子(Ca2+)含量的測定

水稻葉片Ca2+含量測定參照Yang等[40]方法。

1.10 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruv ate carboxylase, PEPC)活性的測定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC, EC 4.1.1.31)酶活性測定參考Qian等[22]的方法。粗酶液提取, 取0.15 g葉片置于研缽冰浴研磨, 其中加入l.5 mL粗酶提取緩沖液[50 mmol?L-1Tris-HCl(三羥甲基)氨基甲烷(pH 7.8)], 5 mmol?L-1二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT), 1 mmol?L-1氯化鎂(MgCl2), 2%聚乙烯毗咯烷酮(/), 在4 ℃下12 000 r×min-1離心10 min, 收集上清液, 即為粗酶液。

酶活性測定反應體系(1 mL): 700 μL蒸餾水, 50 mmol?L-1Hepes-KOH (pH 8.0), 5 mmol?L-1MgCl2, 10 mmol?L-1碳酸氫鈉, 0.2 mmol?L-1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide ade-nine dinucleotide, NAD), 1.5 U蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase), 150 μL粗酶液, 5 mmol?L-1磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpy- ruvate, PEP), 將上述試劑搖勻后, 使用UV-1200紫外分光光度計, 在340 nm處記錄吸光度的變化值, 計算酶活性。

1.11 總RNA的提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應[quantitative real-time (polymerase chain reaction, PCR), QRT-PCR]

根據(jù)Jung等[41]的試驗方法制備總RNA。反轉錄參考Chen等[42]的方法, 在PCR儀(ETC811, 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)上進行。根據(jù)制造商的說明書使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒[TaKaRa Biotechnology(大連)有限公司], 進行QRT-PCR分析。使用Applied Biosystems Step One TM實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行分析。QRT-PCR的反應條件依次為95 ℃ 10 min, 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 40 s和68 ℃ 1 min,共32個循環(huán)。每個試驗重復3次。引物在Primer 3上設計, 以水稻組成性表達的基因為內(nèi)部參照, 引物序列如表1所示。

表1 QRT-PCR的基因和引物

1.12 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行One-Way ANOVA分析, 采用Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進行描述和作圖。QRT-PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt的方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 DCMU處理對干旱脅迫下轉C4-pepc水稻相對含水量及PEPC酶活性的影響

圖1A顯示, 在正常條件下, WT和PC水稻相對含水量沒有顯著差異, 使用12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理2 h, 兩種供試材料的相對含水量均顯著下降, PC顯著高于WT; 而DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理進一步顯著下調兩種供試材料的相對含水量, 且PC仍顯著高于WT (圖1A)。

植物基因在應對逆境脅迫中具有重要的作用, 高溫、干旱以及鹽脅迫都會導致PEPC酶活性及基因表達顯著增加[8,11,43]。從圖1B來看, 12% PEG- 6000處理下PC水稻中PEPC酶活性始終顯著高于WT, 且DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理會顯著降低PC水稻中PEPC酶活性, 而WT水稻中PEPC活性在各處理中無顯著變化(圖1B)。

2.2 DCMU處理對干旱脅迫下轉C4-pepc水稻光合氣體交換參數(shù)的影響

如圖2A-D所示, 相比正常條件下, 12% PEG- 6000模擬干旱脅迫均顯著降低了PC與WT水稻的凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度以及羧化效率, 并且PC與WT之間存在顯著差異(<0.05)。同時, DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理進一步下調PC與WT水稻的凈光合速率、氣孔導度和羧化效率, 且PC顯著高于WT(<0.05)(圖2A、B、D), 而胞間CO2濃度無顯著性變化(圖2C), 說明DCMU根部吸入預處理使供試水稻的光合參數(shù)均顯著下降, 且PC的始終高于WT, 提示除能量傳遞外, 可能還有其他因素參與了PC的耐旱機制。

2.3 DCMU處理對干旱脅迫下轉玉米C4-pepc水稻信號分子的影響

在信號轉導通路中, NO、H2O2和Ca2+都是植物中重要的信號分子[22-23]。由圖3A可知, NO含量在正常情況下PC顯著高于WT, 使用12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理2 h的水稻幼苗, PC與WT中NO含量均顯著下降, 但PC仍顯著高于WT; 而DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理則顯著上調兩種供試材料的NO含量, 其中PC恢復到未處理的對照水平, 而DCUMU處理下WT含量仍顯著低于WT未處理, 且PC顯著高于WT。各處理條件下, PC水稻中H2O2含量始終低于WT(圖3B)。從圖3C可知, DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理上調兩種供試材料中Ca2+含量, 且PC顯著高于WT?？梢? 與單獨PEG-6000模擬干旱脅迫相比, DCMU處理能夠啟動信號分子參與抗旱, 其中PC的變幅更為顯著。

2.4 DCMU處理對12% PEG-6000模擬干旱脅迫下轉玉米C4-pepc水稻可溶性糖和糖組分的影響

可溶性糖含量在干旱脅迫條件下的積累一方面有利于細胞滲透壓的維持, 另一方面還可以作為糖信號調節(jié)其耐旱性[44]。干旱處理顯著上調供試材料的可溶性糖含量, 但WT和PC之間無顯著性差異(圖4A)。正常情況下PC水稻中蔗糖含量顯著高于WT, 使用12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理2 h的水稻幼苗, 均顯著增加了WT和PC中蔗糖含量, 且PC顯著高于WT; DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理顯著下調兩種供試材料的蔗糖含量, 但仍未消除兩個材料的差異, PC仍高于WT(圖4B)。模擬干旱處理也顯著上調了供試材料中葡萄糖和果糖含量, 但DCMU處理對其沒有影響, 且兩供試材料之間沒有顯著差異(圖4C、D)。這些結果提示DCMU處理不僅影響了電子傳遞的能量, 還影響了物質代謝(可溶性糖的變化)。

圖1 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片相對含水量(A)和PEPC活性(B)的影響

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

圖2 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片光合參數(shù)(A: 凈光合速率; B: 氣孔導度; C:胞間CO2 濃度;D: 羧化效率)的影響

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05, LSD test)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

2.5 DCMU處理對干旱脅迫下轉玉米C4-pepc水稻花青素含量及其合成酶基因表達的影響

雖然蔗糖對花青素合成的影響已有報道, 但在干旱條件下光合抑制劑處理后兩者關系的研究少見報道。在試驗過程中, 我們發(fā)現(xiàn)水稻花青素含量在使用12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理之后, 其含量與對照相比顯著上升, 且PC高于WT; 而DCMU和12% PEG-6000聯(lián)合處理顯著下調兩種供試材料的花青素含量, 但PC仍顯著高于WT(圖5)。干旱條件下, 花青素代謝是如何調控的? 兩種材料是否有差異? 這是揭示兩材料光合參數(shù)差異的關鍵。在水稻中, 花青素的生物合成途徑主要是苯丙氨酸途徑。其生物合成的相關基因主要有調節(jié)基因和結構基因2種。調節(jié)基因和與水稻葉片顏色有關,與水稻穎尖的顏色有關。而且,和編碼bHLH轉錄因子,編碼R2R3-MYB類轉錄因子, 它們和花青素合成相關基因一起共同調節(jié)花青素在水稻中的積累[45]。結構基因指直接編碼花青素生物合成相關酶的基因, 主要有苯丙氨酸合成酶基因(,)、查爾酮異構酶基因(,)、查爾酮合成酶基因(,)、黃酮-3-氫化酶基因(,)、黃酮-3’-氫化酶基因(’,’)、二氫黃酮醇還原酶基因(,)、花青素還原酶基因(,)、花青素合成酶基因(,)。我們進一步研究了12% PEG-6000處理和PEG-6000與DCMU聯(lián)合處理分析花青素合成基因的變化情況。

圖6顯示,、和在12% PEG- 6000模擬干旱脅迫處理下表達量均顯著上升, 且PC的表達量顯著高于WT; 而DCMU與12% PEG-6000聯(lián)合處理下兩種供試材料的、和表達量下調, 但PC仍顯著高于WT(圖5B-D)。

圖3 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片NO (A)、H2O2 (B)和Ca2+(C)含量的影響

Fig. 3 Effects of DCMU pretreatment on contents of NO (A), H2O2(B) and Ca2+(C) of C4-gene overexpressed rice (PC) and untransformed wild-type rice (WT) leaves under simulated drought stress

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05, LSD test)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

如圖6所示, 正常條件下, PC中、、、’、和表達量均高于WT(除); 在12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理下, PC中、、、、’、和表達量均顯著上升; 而DCMU與12% PEG-6000聯(lián)合處理后其表達量顯著下降(除), 但PC始終高于WT。總體而言, 在干旱條件下PC水稻中花青素合成相關基因更高的轉錄水平有利于合成更多的花青素。

2.6 DCMU處理對干旱脅迫下轉玉米C4-pepc水稻花青素調節(jié)因子的影響

供試材料在模擬干旱條件下, 在轉錄水平上引起花青素調節(jié)和合成相關基因的表達差異, 結合本研究觀察到第二信使分子NO含量分析的變化, 提示可能存在涉及花青素靶基因上游轉錄因子的變化。已經(jīng)有研究表明: 除了MBW(MYB-BHLH- WD40)轉錄因子以外, 已知COP1(constitutively photomorphogenic 1)和HY5(elongated hypocotyl 5)也是花青素調節(jié)中的兩個重要的轉錄因子[46-47], 為此, 在本研究中進一步分析了其基因的表達。由圖7A可知, 在正常情況下, PC中顯著高于WT; 12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理下, 兩種供試材料的均顯著升高, 且PC顯著高于WT; 而DCMU和12% PEG-6000聯(lián)合處理下調了兩種供試材料的表達量, 但PC仍顯著高于WT。在正常條件下, 兩種供試材料的表達量無顯著差異, 在12% PEG-6000模擬干旱脅迫處理下, PC中顯著上升, 且PC顯著高于WT; 而DCMU和12% PEG-6000聯(lián)合處理下調PC的表達量, 但PC仍顯著高于WT(圖6B)。綜上, 在干旱條件下, PC可能通過第二信號分子NO和Ca2+的信號傳導過程, 誘導了轉錄因子的變化, 從而增強花青素的積累。

3 討論與結論

在水稻生長過程中會遭受到各種環(huán)境脅迫, 例如高溫、高光、干旱、鹽和生物脅迫等影響。干旱脅迫引起氣孔關閉, 胞間CO2濃度降低, 碳同化速率降低, 葉片吸收的光能過剩, 造成光合器官的光化學效率及光合速率降低, 發(fā)生光抑制甚至光破壞, 導致作物光合能力降低, 最終導致作物減產(chǎn)[48]。光合機構對干旱造成的水分脅迫有一定的耐受性, 通過光呼吸和熱耗散增加等許多途徑耗散掉多余的激發(fā)能, 以有效緩解光合作用中光抑制所產(chǎn)生的不良影響, 從而形成多種保護機制[49]。

在氣孔開放期間, 高表達轉玉米C4型基因水稻的保衛(wèi)細胞中PEPC可特異性調控導致蘋果酸或草酰乙酸積累, 促進氣孔開放, 增強光合作用[50]。

圖4 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片可溶性糖(A)、蔗糖(B)、葡萄糖(C)和果糖(D)含量的影響

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

圖5 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片花青素含量影響

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

3,3-二氯-二羥基膦?；?甲基-2-丙烯酸酯(DCDP, 3,3-dichloro-2-dihydroxyphosphinoyl-methyl-2-propenoate)(PEPC的抑制劑)存在條件下, 可限制氣孔開放[51-52]。而使用光合作用的抑制劑DCMU能夠阻斷PSⅡ中QA和QB之間的電子流動, 改變植株的能量狀態(tài)而影響光合能力。已有研究表明, DCMU對植株光合過程的影響是通過不同的光質造成的, 通過氣孔對不同波長光的反應發(fā)現(xiàn)DCMU在紅光下可以抑制光合作用的進行, 而在藍光下卻促進了光合作用[53]。在紅光下, 促進保衛(wèi)細胞的葉綠體向細胞質中提供ATP, 這些ATP是質膜上的H+-ATPase形成質子泵和氣孔張開所必需的[54], 可見, DCMU是通過調節(jié)植物體內(nèi)的能量狀態(tài)而影響光合的。前期的研究表明, 在干旱脅迫條件下, 與原種相比, PEPC的高表達能夠維持較高的PSⅡ活性, 也產(chǎn)生較高的ATP, 來維持凈光合速率的穩(wěn)定[13]。本試驗通過在模擬干旱脅迫條件下通過外源添加DCMU到高表達轉C4-基因水稻植株, 結果顯示: PC中凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2及羧化效率在DCMU處理之后仍顯著高于WT, 且DCMU處理使得PC水稻中PEPC酶活性顯著下降, 但PC中PEPC酶活性始終高于WT, 說明兩供試材料能量狀態(tài)的差異是導致其干旱表現(xiàn)的重要原因, 但還存在其他的機制。本研究發(fā)現(xiàn)供試材料中總可溶性糖和內(nèi)源蔗糖含量變化趨勢與光合參數(shù)類似。已有研究表明: 在逆境條件下, 蔗糖可參與誘導花青素的積累[55]。在多種植物中, 花青素積累的組織特異性已被證明通過R2R3-MYB、bHLH和WD40轉錄因子3大類基因家族調節(jié)[29]。由MYB、bHLH和WD40所形成的三元復合體(MBW復合體), 其功能已經(jīng)在模式植物擬南芥中得到詳細闡述。本研究涉及MYB和bHLH兩個轉錄因子, 其中編碼R2R3-MYB類轉錄因子,和編碼bHLH轉錄因子, 有文獻表明和必需與MYB類轉錄因子互作才能發(fā)揮功能[56]。從結果來看PC水稻中、和在逆境條件下均顯著高于WT, 而DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理之后其轉錄水平顯著下降, 但PC始終顯著高于WT。而對于WD40, 已經(jīng)在擬南芥、玉米、苜蓿(L.)、甘薯[(Lour.)L.]等中報道過WD40類花色苷轉錄因子[30,57],而WD40在水稻響應非生物逆境的研究有限。本研究表明: 花青素含量、花青素合成基因以及調節(jié)它的轉錄因子的表達也與蔗糖的變化相一致, 如、、、、、、、’、、、轉錄水平在模擬干旱條件下呈現(xiàn)出同步變化趨勢, 提示蔗糖可能參與花青素的調節(jié)和合成基因的表達。有研究表明蔗糖與植物抗逆的調節(jié)與Ca2+、NO以及H2O2等信號有非常密切的聯(lián)系[34,58], 本研究的確也觀察到兩材料在不同處理下, 其體內(nèi)第二信使分子含量如Ca2+、NO以及H2O2的差異, 其中DCMU處理對NO含量的影響最為顯著, 而且加劇了供試材料的差異表現(xiàn), 說明PC可能通過NO參與蔗糖依賴的花青素積累的調節(jié), 有關信息還需要今后NO與花青素的直接證據(jù)驗證。

圖6 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片花青素合成酶基因表達的影響

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05, LSD test)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

圖7 DCMU預處理對模擬干旱脅迫下高表達轉C4-pepc基因水稻(PC)和野生型水稻(WT)葉片花青素調節(jié)因子的影響

CK: 正常水培培養(yǎng); PEG: PEG單獨施加模擬干旱處理; DCMU+PEG: DCMU預處理之后聯(lián)合模擬干旱脅迫處理。不同小寫字母表示W(wǎng)T和PC的不同處理間差異顯著(<0.05, LSD test)。CK: normal hydroponic culture; PEG: PEG simulated drought stress; DCMU+PEG: DCMU pretreatment plus simulated drought stress. Different lowercase letters indicate signi?cant differences among different treatments of WT and PC at< 0.05.

已知植物花青素的合成是一個需光過程, 在光條件下, 光受體接收光信號, 通過信號轉導形成細胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)級聯(lián)傳遞來調節(jié)包括花青素合成在內(nèi)的光形態(tài)建成反應[59]。有研究表明: E3泛素連接酶組成型光形態(tài)建成(COP1)是位于光受體下游一個光形態(tài)建成的抑制子, 是一個光調控植物生長發(fā)育的分子開關。在暗條件下, COP1抑制光反應。COP1/SPA復合體與MYB調控因子互作調控花青素合成的結構基因的表達, 從而影響花青素的合成[59], 此外, 黑暗條件下植物光形態(tài)建成調控因子 COP1積累在細胞核內(nèi), 直接與堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)類轉錄因子HY5相互作用, 并被蛋白酶降解, 負調控下游基因的表達; 而在光下COP1從細胞核內(nèi)轉移到細胞核外, 從而HY5在細胞核內(nèi)積累, 可特異結合于查爾酮合成酶基因等光誘導基因啟動子上, 正調控相關基因的表達[60]。進而, 本文對轉錄因子也進行了研究, 從本研究結果可以看到, 在12% PEG-6000模擬干旱條件下, 在PC中和的轉錄表達與MYB和bHLH轉錄因子呈現(xiàn)出一致的結果, 在逆境條件下均顯著高于WT, 而DCMU聯(lián)合12% PEG-6000處理之后其轉錄水平顯著下降, 但PC始終顯著高于WT。同時, 編碼植物花青素的生物合成的7個基因中除以外、、、’、、與轉錄因子呈現(xiàn)出相一致的表達水平。

綜上所述, 在干旱條件下, PC材料一方面可通過電子傳遞的能量差異應對干旱逆境, 還可以通過內(nèi)源蔗糖含量的差異, 并通過第二信使Ca2+、NO感受干旱信號, 參與轉錄因子的調節(jié)(比如和), 進而參與花青素合成基因的調控, 合成較多的花青素, 從而增強PC水稻對干旱逆境的響應?？傊? 本研究提供了水稻中花青苷合成調控的新線索, 但蔗糖如何誘導PC的花青素調節(jié)相關的轉錄因子響應干旱的精確機制, 還需要今后的直接證據(jù)證實。

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Effects of DCMU on anthocyanin synthesis genes and its related signals in C4-gene overexpressed rice under drought conditions*

HE Yafei1,2, XU Mengjie1,3, LI Xia1**

(1. Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Jiangsu High Quality Rice Engineering Technology Research Center / Nanjing Branch of National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China;2. College of Biology and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 3. Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China)

Anthocyanins are important antioxidant materials that protects plant from damage by reactive oxygen species (ROS). Especially under adverse conditions, the regulation of sucrose in plants depends on its ability to induce anthocyanin accumulation. To determine the intrinsic relationship between photosynthetic and anthocyanin regulated pathways for C4-phosphoenolpyruvate carboxylate (PEPC, EC 4.1.1.31) gene overexpressed rice (PC) in drought conditions, PC and untransformed wild-type (WT) were treated with 50 μmol?L-1photosynthetic inhibitor DCMU for 1 h and the performance of the rice seedlings at 4-5 leaf stage observed under 12% PEG-6000 simulated drought. The results showed that DCMU pretreatment significantly reduced relative water contents of WT and PC under simulated 12% PEG-6000 drought condition, and relative water content of PC was significantly higher than that of WT. The anthocyanin content was higher in PC than in WT under 12% PEG-6000 simulated drought or drought plus DCMU pretreatment. 12% PEG-6000 simulated drought decreased anthocyanin contents of PC and WT, while DCMU pretreatment alleviated this effect. Compared with 12% PEG-6000, DCMU plus 12% PEG-6000 significantly inhibited net photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular CO2and carboxylation efficiency of the two rice lines, but these parameters of PC lines were significantly higher than those of WT lines. Then DCMU plus 12% PEG-6000 down-regulated endogenous sucrose content of the two materials, but sucrose content of PC lines was significantly higher than that of WT lines. Further studies showed that higher sucrose level in PC was associated with higher expression levels of transcriptional factors of(,),(),(constitutively photomorphogenic 1),(elongated hypocotyl 5),,,,,’,andwhich resulted in synthesizing more anthocyanin to improve water retention capacity. In addition, PC rice sensed drought signals through NO and Ca2+, which participated in the regulation of transcription factors, regulation of anthocyanin synthesis gene, synthesis of more anthocyanin and thereby enhanced PC rice response to drought stress. This enhanced water retention capacity, stabilized photosynthetic capacity and resisted drought. Therefore, it was beneficial in molecular breeding of “C4Rice” to study the symphony between high yield and plant resistance.

C4-gene overexpressed rice; Phosphoenolpyruvate carboxlase; Sucrose; Anthocyanin; DCMU; Drought

, E-mail: jspplx@jaas.ac.cn

10.13930/j.cnki.cjea.170647

S311; S338

A

1671-3990(2018)03-0409-13

李霞, 主要研究方向為植物光合生理。E-mail: jspplx@jaas.ac.cn何亞飛, 主要研究方向為作物逆境生理。E-mail: 1368267588@qq.com

2017-07-17

2017-08-22

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571585), the Special Project for Basic Research of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (ZX[16]2002) and the Grant from the Institute of Food Crops of Jiangsu Academy of Agriculture Sciences (LZS17-9).

* 國家自然科學基金項目(31571585)、江蘇省農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項(ZX[16]2002)和江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所基金 (LZS17-9)資助

Jul. 17, 2017; accepted Aug. 22, 2017

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