氟苯尼考對嗜水氣單胞菌的防突變濃度

單奇，劉書貴，馬麗莎，李麗春，鄭光明

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(廣州)，廣東 廣州 510380)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為弧菌科氣單孢菌屬，該菌廣泛分布于淡水、咸水、河水和海水中[1]，從健康或患病水產(chǎn)動物體內(nèi)均能分離得到，可引起多種淡水魚類發(fā)生爛鰓病、爛尾病、流行性潰瘍綜合征和細(xì)菌性敗血癥等[2-3]。近年來該菌引起疾病更是呈爆發(fā)趨勢，由嗜水氣單胞菌引起的混合感染已成為鯉科魚類養(yǎng)殖的主要病害[4]。

氟苯尼考(florfenicol)為動物專用第3代氯霉素類廣譜抗菌藥物，與氯霉素和甲砜霉素相比，因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強和副作用小等特點[5]，被廣泛用于水產(chǎn)病害防治。氟苯尼考對大多數(shù)魚類病原菌都具有較強的抗菌活性，包括嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、發(fā)光桿菌、愛德華氏菌、遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌等[6]。歐洲、挪威、加拿大、日本、中國、韓國均已批準(zhǔn)氟苯尼考用于各種水產(chǎn)動物[7]。然而，隨著氟苯尼考在水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病治療上的廣泛使用甚至濫用，多種魚類病原菌已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥性，如嗜水氣單胞菌[8]、維氏氣單胞菌[9]、肺炎克雷伯氏菌[10]、沙門氏菌[11]等。很多學(xué)者倡導(dǎo)通過優(yōu)化給藥方案來減少耐藥菌株的產(chǎn)生、傳播和擴散。

防突變濃度(MPC)是指防止步耐藥突變菌株選擇性富集擴增所需的最低藥物濃度[12]。最低抑菌濃度(MIC)和防突變濃度(MPC)之間的藥物濃度范圍稱為突變選擇窗(MSW)[13]。防突變濃度(MPC)理論認(rèn)為血藥濃度始終高于MPC，不僅可以發(fā)揮好的療效，也會防止菌株發(fā)生耐藥突變；血藥濃度始終處于MIC以下，雖不能產(chǎn)生預(yù)期療效，但低水平藥物濃度壓力下，菌株發(fā)生耐藥的幾率也很低；相反，血藥濃度在整個給藥間隔或較長時間處于突變選擇窗內(nèi)，即使臨床治療成功，菌株發(fā)生耐藥突變的機率也加大[12-13]。因此，在獸醫(yī)臨床用藥時，將血藥濃度維持在MPC以上，不僅可以達(dá)到最佳療效，也可以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。本實驗擬通過測定氟苯尼考對多株嗜水氣單胞菌的MIC和MPC，為水產(chǎn)臨床優(yōu)化氟苯尼考的給藥方案、減少耐藥菌株的產(chǎn)生提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品

氟苯尼考對照品(含量99%)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氟苯尼考原料藥(含量98%)，珠江水產(chǎn)研究所藥廠惠贈。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基

受試菌41株，其中嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7966由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所魚病研究室提供，40株嗜水氣單胞菌(表1)于2015—2016年分離自廣東省佛山、中山和肇慶等重點養(yǎng)殖區(qū)域患病的水生動物。Mueller-Hinton(MH)瓊脂、MH肉湯均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

表1 菌株來源與背景Tab.1 Source and background of the Aeromonashy drophilia strains

1.2 實驗方法

1.2.1 MIC和MIC99的測定

采用瓊脂平板二倍稀釋法測定氟苯尼考對嗜水氣單胞菌的MIC，MH瓊脂平板所含藥物的質(zhì)量濃度范圍為0.031～128 μg/mL，將處于對數(shù)生長期的菌懸液，用新鮮的MH肉湯稀釋調(diào)整到1×105CFU/mL，每個平板接種100 μL(最終接種量約為1×104CFU)，28℃培養(yǎng)24 h后，按美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)2010年頒布的無細(xì)菌生長的最低藥物濃度判定為MIC。

在測得的MIC的基礎(chǔ)上，依次遞減20%至1/2MIC藥物濃度，制成含不同藥物濃度的瓊脂平板。將處于對數(shù)生長期的菌落溶于無菌生理鹽水中, 調(diào)整濃度至3×107CFU/mL，再經(jīng)無菌生理鹽水10倍倍比稀釋至3×102CFU/mL。將不同稀釋倍數(shù)的菌液各取100 μL接種于平板上，使每個藥物濃度平板上的含菌量分別為3×106、 3×105、 3×104、 3×103、 3×102CFU。28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑選合適的平板計數(shù)，按照崔俊昌等[14]報道的方法計算MIC99(抑制99%細(xì)菌生長的最低抑菌濃度)。

1.2.2 MPCpr和MPC的測定

從長有嗜水氣單胞菌的瓊脂平板上挑取3個菌落接種于10 mL新鮮的MH肉湯中，28 ℃恒溫?fù)u床上過夜培養(yǎng)，3 500 r/min離心20 min后，將富集后的細(xì)菌再懸浮在100 mL新鮮的 MH肉湯中，28 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)6 h，將全部菌液經(jīng)3 500 r/min離心20 min后富集，用無菌生理鹽水將菌液濃度稀釋到3×1010CFU/mL。

在測得的MIC基礎(chǔ)上，制得系列藥物濃度為1、2、 4、 8、 16、 32和64 MIC的MH瓊脂平板，每個藥物濃度各設(shè)4個平行，每個平板接種100 μL菌懸液，最終嗜水氣單胞菌接種量為1.2×1010CFU。接種后的平板放置在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。以72 h 后孵育不出菌落的最低藥物濃度設(shè)為暫定防突變濃度(MPCpr)。然后在測得的MPCpr的基礎(chǔ)上，依次遞減(20%)藥物濃度，制備含藥平板，沒有出現(xiàn)菌落生長的最低藥物濃度即為MPC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件內(nèi)嵌的probit回歸模型對氟苯尼考藥效學(xué)數(shù)據(jù)(MIC和MPC)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算氟苯尼考對多株嗜水氣單胞菌的MIC50、MIC90和MPC90。

2 結(jié)果

2.1 氟苯尼考對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC、MIC99和MPC

采用瓊脂稀釋法測定，氟苯尼考對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC為1.0 μg/mL、MIC99為0.8 μg/mL，MPC為4.8 μg/mL，MSW(MIC99～MPC)為0.8～4.8 μg/mL、SI(MPC/MIC99)為6。

2.2 氟苯尼考對嗜水氣單胞菌臨床分離株的MIC50、MIC90和MPC90

氟苯尼考對40株臨床分離的嗜水氣單胞菌的MIC和MPC見表2。由表2中可知，氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌的MIC范圍為0.5～4.0 μg/mL，基于SPSS Probit模型計算所得MIC50和MIC90分別為1.0和2.0 μg/mL；氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌的MPC為3.2～25.6 μg/mL，基于SPSS Probit模型計算所得MPC50和MPC90分別為6.4和16.0 μg/mL，MSW(MIC90～MPC90)和SI(MPC90/MIC90)分別為2.0～16.0 μg/mL和8。

表2 氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌臨床株的最低抑菌濃度(MIC)和防突變濃度(MPC)Tab.2 MIC and MPC of florfenicol against 40 isolates of Aeromonashy drophilia

3 討論

抗菌藥物的大量使用，特別是毫無節(jié)制的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重。然而新藥研發(fā)費用巨大且周期很長，因此充分利用現(xiàn)有藥物，并利用藥動學(xué)和藥效學(xué)理論來制定合理的給藥方案是防止和控制耐藥性產(chǎn)生的有效辦法。傳統(tǒng)生產(chǎn)中，抗菌藥物的使用以治愈疾病而非阻止耐藥為目標(biāo)，藥效學(xué)參數(shù)主要以MIC為指導(dǎo)，其著眼點是通過抗菌藥物殺死或抑制敏感細(xì)菌，依賴宿主防御系統(tǒng)清除突變菌，從而達(dá)到控制感染，減少嚴(yán)重不良反應(yīng)的目的，但大量反復(fù)使用抗菌藥物所產(chǎn)生的選擇壓力，使細(xì)菌中的突變亞群逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢菌群，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生不同水平的耐藥性。這就迫切需要尋找新的治療策略，在控制感染的同時，防止細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展。美國學(xué)者Zhao及其團隊[15-16]于1999年首先提出了關(guān)于細(xì)菌MPC和MSW的理論，將MPC作為評價抗菌藥物新的藥效學(xué)指標(biāo)，為臨床優(yōu)化抗菌藥物給藥方案，限制耐藥突變體選擇性擴增提供了新思路，也對新藥的開發(fā)提出了新要求。MPC與MSW治療策略既要控制感染，又要防止耐藥。選擇MPC低、MSW窄的藥物，調(diào)整劑量和給藥方案，聯(lián)合用藥，規(guī)律用藥，有助于關(guān)閉或縮小MSW，減少耐藥突變菌選擇性富集擴增的機率，達(dá)到防止細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的目的。本實驗測定了氟苯尼考對嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7966和40樣臨床分離菌的MIC和MPC，為臨床合理用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本實驗測得氟苯尼考對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC為1.0 μg/mL。而吳雅麗等[17]報道恩諾沙星、多西環(huán)素和甲氧芐啶對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC分別為0.002、 0.125和2.000 μg/mL。Libisch等[18]報道環(huán)丙沙星、慶大霉素、四環(huán)素對嗜水氣單胞菌ATCC7966的MIC分別為<0.5、 2.0和0.5 μg/mL。表明恩諾沙星、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素對嗜水氣單胞菌ATCC7966的抗菌活性可能優(yōu)于氟苯尼考，而甲氧芐啶和慶大霉素對嗜水氣單胞菌ATCC7966的抗菌活性可能不如氟苯尼考。

本實驗中氟苯尼考對40株嗜水氣單胞菌分離菌的MIC為0.5～4.0 μg/mL，MPC為3.2～25.6 μg/mL，SI為4.8～12.8。李夢影等[19]測得氟苯尼考對 1株嗜水氣單胞菌的MIC為0.5 μg/mL，MPC為6.0 μg/mL，SI為12，這些參數(shù)數(shù)值均在本實驗測定的相應(yīng)參數(shù)數(shù)值的范圍之內(nèi)，說明本實驗選取菌株數(shù)量較多，所得數(shù)據(jù)具有一定程度的代表性。然而俞觀泉等[20]測得氟苯尼考對5株嗜水氣單胞菌的MIC為8.0～19.2 μg/mL，MPC均大于128 μg/mL，這些數(shù)值與本實驗數(shù)據(jù)相比存在著較大差異，這可能是所用菌株本身MIC值較高所致。SI為選擇指數(shù)，是MPC與MIC的比值，用于比較抗菌藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥突變株的能力，選擇指數(shù)越小，MSW窗口越窄，篩選出耐藥菌株的機會就越小；反之，選擇指數(shù)越大，MSW窗口越寬，產(chǎn)生耐藥菌株的機會就越大。本實驗不同臨床分離株選擇指數(shù)差異較大，這可能與不同菌株發(fā)生耐藥突變的基因不同有關(guān)。MIC范圍為0.5～4.0 μg/mL，MIC50和MIC90分別為1.0和2.0 μg/mL；MPC為3.2～25.6 μg/mL，MPC50和MPC90分別為6.4和16.0 μg/mL。

李夢影等[19]報道鯽口服10 mg/kg氟苯尼考，血漿中氟苯尼考達(dá)峰時間為4.0 h，峰濃度為7.80 μg/mL，消除半衰期為92.11 h。根據(jù)2010年版《獸藥使用指南(化學(xué)藥品)》對于各種水產(chǎn)動物，氟苯尼考口服給藥推薦劑量為10 mg/kg(以氟苯尼考計)。國內(nèi)批準(zhǔn)上市的水產(chǎn)用氟苯尼考粉說明書上的推薦劑量為：“以氟苯尼考計，每1 kg體重魚、蝦、蟹拌餌投喂10～15 mg”。據(jù)文獻(xiàn)報道，水產(chǎn)動物口服10～15 mg/kg 氟苯尼考，血藥濃度達(dá)峰時間一般為3～12 h，峰濃度在2.37～7.80 μg/mL之間[19，21-23]。此時氟苯尼考血藥濃度雖遠(yuǎn)在MIC90之上，但是卻顯著低于MPC90(16.0 μg/mL)，落在了MSW內(nèi)，菌株發(fā)生耐藥突變的機率加大。因此，按照氟苯尼考推薦給藥方案，容易出現(xiàn)細(xì)菌耐藥性。研究表明氟苯尼考為濃度依賴性藥物，其殺菌作用和臨床療效隨著血藥濃度的增加而增加[24]。本實驗得到的MPC90高達(dá)16.0 μg/mL，而氟苯尼考在鯽和草魚體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究表明，即使增加給藥劑量到30 mg/kg，也無法使血藥濃度處于MPC90以上[19]。加大給藥劑量使血藥濃度始終處于MPC90之上，這樣既可以清除細(xì)菌，又能避免出現(xiàn)耐藥菌株。但是因為藥物毒副作用和藥物殘留問題，臨床用藥時不能隨意提高給藥劑量，因此該法難以在臨床上推廣。有研究表明，聯(lián)合用藥可以縮小或關(guān)閉病原菌的突變選擇窗，氟苯尼考聯(lián)合多西環(huán)素使氟本尼考對3株大腸桿菌的MPC分別由原來的256.0、 128.0、 460.8 μg/mL，變?yōu)?.0、 8.0、 16.0 μg/mL，均關(guān)閉了MSW，有效抑制了耐藥突變菌株的產(chǎn)生[25]。盧靜等[26]報道在聯(lián)合藥敏試驗中，沒食子酸或槲皮素與氟苯尼考聯(lián)合用藥對嗜水氣單胞菌具有協(xié)同作用，有助于降低抗生素的用量及殘留。理論上，通過聯(lián)合用藥，耐藥菌株的產(chǎn)生必須同時對兩種藥物發(fā)生耐藥突變，發(fā)生的概率約為10-14～10-18，因此不易產(chǎn)生耐藥性[27]。以上研究表明，單純使用氟苯尼考易導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)生耐藥性，或許將氟苯尼考與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，是縮小甚至關(guān)閉耐藥突變選擇窗的最佳選擇。因此，下一步仍需繼續(xù)研究氟苯尼考和其他抗菌藥物合用對嗜水氣單胞菌耐藥突變的影響，并結(jié)合藥動學(xué)數(shù)據(jù)，探索制定氟苯尼考在水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理使用的具體方案，以更好地服務(wù)實際生產(chǎn)。

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