恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝動力學

牛曰華，張?zhí)炻?，鄒紅梅，朱琳，陳庚，施媛媛，費海榕，楊云輝

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心， 福州350003)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類和出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品。福建沿海是大黃魚最主要的養(yǎng)殖區(qū)域。2016年福建省大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為1.465×105t，占中國大黃魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的 88.53%[1]。

恩諾沙星(enrofloxacin)是人工合成的第3代喹諾酮類(quinolones)藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用，主要用來治療細菌性疾病，具有抗菌譜廣、抗菌活性強以及與其他抗生素無交叉耐藥性等特點[2]，其在動物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)。環(huán)丙沙星同樣也具有較強的抗菌活性。但此類藥物容易引起細菌的耐藥性，從而對人體健康和生態(tài)環(huán)境帶來損害[3]，因此中國農(nóng)業(yè)部制定了恩諾沙星殘留限量標準，規(guī)定恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星總殘留量在水產(chǎn)動物肌肉中不得超過100 μg/kg[4]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，若不合理使用恩諾沙星，往往會造成藥物殘留超標，而藥物在動物體內(nèi)的代謝過程和消除規(guī)律則是制定用藥方案和休藥期的理論基礎，因此開展恩諾沙星在水產(chǎn)動物中的代謝動力學和殘留消除研究，對促進水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展和保障廣大消費者的健康具有重要意義。目前已開展恩諾沙星藥物代謝動力學和殘留消除研究的水產(chǎn)動物主要有大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[5-7]、日本鰻鱺(Anguillajaponica)[8]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[9-10]、烏鱧(Ophicephalusargus)[11]、鱘(Acipenserschrenckii)[12]、黑裙(Sebastodesfuscescens)[13]、吉富羅非魚(JifuTilapia)[14]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[15]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[16]、中國對蝦(Penaeuschinensis)[14]、凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)[17]、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[18]、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[19]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[20]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[21-22]等，尚未見在大黃魚體內(nèi)代謝規(guī)律的研究。

本研究以大黃魚為實驗對象，采用肌注給藥方式，研究恩諾沙星及其主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的藥代動力學和殘留消除規(guī)律，并提出休藥期建議，以期為大黃魚養(yǎng)殖過程中科學使用恩諾沙星提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚

健康大黃魚由福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司提供，魚體重在200～300 g之間。實驗前大黃魚在寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖池暫養(yǎng)一周。隨機抽取5尾，進行血漿、肌肉、肝臟和性腺等組織的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，確認無恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留。實驗用飼料為福建天馬科技集團股份有限公司生產(chǎn)的人工配合飼料，經(jīng)檢測均不含恩諾沙星和環(huán)丙沙星。

本實驗于2016年12月至2017年2月在福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司進行。在整個實驗過程中，大黃魚養(yǎng)殖池水溫從23 ℃逐漸降至17 ℃。實驗期間大黃魚成活率為100%。

1.1.2 儀器設備

實驗中使用的主要儀器包括：QTRAP 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)；Waters Acquity超高效液相色譜儀；BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；Sigma 3-30K高速冷凍離心機；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS3渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

1.1.3 藥品與試劑

實驗主要試劑包括：恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準品(純度≥98%，德國CNW公司)，恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8(純度≥98%，德國Witega公司)。丁香油水門汀(上海醫(yī)療器械股份有限公司)；肝素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈、乙酸銨(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；無水硫酸鈉(分析純，國藥集團)。

1.2 方法

1.2.1 注射用恩諾沙星藥液的配制

精確稱取恩諾沙星標準品5.000 g，用適量5%冰醋酸溶解，再用超純水定容至100 mL，搖勻，得到恩諾沙星溶液濃度為50 mg/mL。

1.2.2 肌注給藥和樣品采集

取20 L海水于實驗桶中，加入1 mL丁香油水門汀，攪拌均勻，此時丁香油水門汀質(zhì)量濃度為50 mg/L。將實驗用大黃魚放入實驗桶中，待完全麻醉后，取出稱重，按50 mg/kg魚體重的劑量對魚背部肌肉進行注射。分別于給藥后的5、10、15、30 min，1、2、4、8、12 h和1、2、4、5、7、9、11、13、20、30、45、60 d，采集血漿、肌肉、肝臟和性腺組織，每個采樣時間點采集5尾魚。以尾靜脈采血的方式采集血漿，將采集的血漿轉(zhuǎn)移至2 mL預先用1%肝素鈉溶液處理過的離心管中，以2 348 g轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液血清為血漿樣品，儲存于-20 ℃保存待檢。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters Acquity BEH C18柱，50 mm×2.1 mm，粒徑1.7μm；流動相A為0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速為0.200 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1.00 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

注：流動相A為0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸銨)；流動相B為乙腈。

離子化模式為大氣壓噴霧電離源(ESI)，正離子模式；噴霧電壓5 500 V；氣簾氣(curtain gas)35 psi；碰撞氣(collision gas)7 psi；霧化氣(gas 1)50 psi；輔助加熱氣(gas 2)50 psi；離子源溫度500 ℃；采用選擇反應監(jiān)測(MRM)掃描模式，選擇反應監(jiān)測母離子、子離子、去簇電壓(DP)和碰撞能量見表2。

1.2.4 樣品處理與檢測

對于肌肉、肝臟和性腺樣品，參照農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008[23]的方法進行檢測。對于血漿樣品，按下述方法進行檢測：取1.00 mL血漿樣品至10 mL離心管中，準確加入25 μL 1.00 mg/L內(nèi)標溶液，然后加入5 mL 1%的甲酸-乙腈溶液(V/V)，渦旋混合1 min，再加入3 g無水硫酸鈉，再次渦旋混合1 min，以 9 391 g轉(zhuǎn)速離心5 min。殘渣重復提取1次，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL雞心瓶中，40 ℃水浴旋蒸至近干，用1 mL流動相溶解，過0.22 μm濾膜后上機檢測。

表2 MRM模式下質(zhì)譜測定的特征離子Tab.2 Characteristic ions of mass spectrum determination in MRM mode

注：標*為定量離子。

當樣品中環(huán)丙沙星和恩諾沙星含量過高時，可適當減少稱樣量，或同倍數(shù)的加大內(nèi)標加入量和定容體積，使樣液濃度落在線性范圍內(nèi)。

1.2.5 方法的回收率和精密度

往大黃魚空白基質(zhì)(血漿、肌肉、肝臟、性腺)中添加環(huán)丙沙星和恩諾沙星混標溶液，使其含量為2、10、100 μg/L(或 μg/kg)3個水平，每個水平6份平行。按照1.2.4的方法進行處理，計算回收率和相對標準偏差。

1.2.6 休藥期計算

恩諾沙星是按一級動力學在體內(nèi)消除的，即在消除后期服從指數(shù)消除：C=C0e-Ket。休藥期的計算公式為：

式(1)

式(1)中，T為休藥期(h)；C0為殘留消除半對數(shù)曲線的縱截距(mg/kg)；MRL為最高殘留限量(mg/kg)；Ke為殘留消除曲線速率常數(shù)，t為給藥后某個時間點。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗采用DAS 2.0藥代動力學軟件以及Origin 8.0、Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果

2.1 分析方法驗證

在質(zhì)量濃度1 ～ 100 μg/L范圍內(nèi)，以恩諾沙星和環(huán)丙沙星峰面積與其內(nèi)標物峰面積之比為縱坐標(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得到恩諾沙星和環(huán)丙沙星曲線方程分別為Y=1.177 10X+0.003 62和Y=1.892 67X- 0.076 07，相關系數(shù)R2均大于0.99。這表明恩諾沙星和環(huán)丙沙星在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好。兩種藥物在血漿中的檢測限均為2 μg/L，在肌肉、肝臟和性腺中的檢測限分別為1、2、2 μg/kg。方法的回收率和精密度見表3，滿足殘留分析要求。

表3 環(huán)丙沙星和恩諾沙星在大黃魚組織中的回收率和精密度Tab.3 Recovery and precision of enrofloxacin and ciprofloxacin in Larimichthys crocea n=6

2.2 藥代動力學

2.2.1 恩諾沙星藥代動力學

大黃魚以50 mg/kg的劑量肌注給藥后，血漿、肌肉、肝臟和性腺中的恩諾沙星含量變化如圖1所示。給藥后，血漿中的恩諾沙星濃度呈直線上升趨勢，在給藥后10 min即達到最大質(zhì)量濃度41.5 mg/L；肌肉中恩諾沙星在給藥后30 min達到最高含量水平108 mg/kg；肝臟中恩諾沙星在給藥后1 h達到最高含量水平68.8 mg/kg；性腺中恩諾沙星在給藥后1 h達到最高含量水平22.5 mg/kg，之后開始迅速下降。

應用DAS 2.0軟件對恩諾沙星濃度-時間關系進行房室模型分析，結果表明，恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的代謝過程符合二室開放模型，藥物時量曲線方程分別為：C血漿=23.805e-0.639t+4.256e-0.023t，C肌肉=19.569e-0.049t+0.227e-0.01t，C肝臟=21.277e-0.097t+5.532e-0.014t，C性腺=25.051e-0.037t+0.084e-0.01t， 主要動力學參數(shù)如表4所示。

圖1 恩諾沙星在大黃魚各組織中的含量變化(a)血漿；(b)肌肉；(c)肝臟；(d)性腺。圖(a)～(d)中右上圖為給藥后0～12 h恩諾沙星在大黃魚各組織中的含量變化。Fig.1 Variation of enrofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during the experiment(a)plasma; (b) muscle; (c) liver; (d) gonad. The top right-hand corner of Fig. (a)-(d) mean the variation of enrofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during 0-12 h after intramuscular injection.

2.2.2 環(huán)丙沙星藥代動力學

環(huán)丙沙星為恩諾沙星主要代謝產(chǎn)物。恩諾沙星肌注給藥后，環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的含量變化如圖2所示。給藥后5 min，在肝臟、血漿、肌肉組織中即檢測到環(huán)丙沙星，之后環(huán)丙沙星含量呈上升趨勢，直至到達最大值，其中肝臟和血漿中的環(huán)丙沙星含量上升迅速，性腺和肌肉中的環(huán)丙沙星含量上升速率較肝臟和血漿中慢。在肝臟中，環(huán)丙沙星含量具有明顯的雙峰現(xiàn)象，在給藥后1 h達到最大峰值3.96 mg/kg，在給藥后4 h形成第二個峰值2.18 mg/kg。血漿中的環(huán)丙沙星在給藥后1 h質(zhì)量濃度達到最大值0.693 mg/L。肌肉和性腺中的環(huán)丙沙星均在給藥后24 h達到最大值，含量分別為0.579 mg/kg和1.11 mg/kg。

應用DAS 2.0軟件對環(huán)丙沙星濃度-時間關系進行房室模型分析，結果表明，環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的代謝過程不符合一室和二室模型。

表4 恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in Larimichthys crocea

圖2 環(huán)丙沙星在大黃魚各組織中的含量變化(a)血漿；(b)肌肉；(c)肝臟；(d)性腺。圖(a)～(d)中右上圖為給藥后0 ～ 24 h環(huán)丙沙星在大黃魚各組織中的含量變化。Fig.2 Variation of ciprofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during the experiment(a)plasma; (b) muscle; (c) liver; (d) gonad. The top right-hand corner of Fig. (a)-(d) mean the variation of ciprofloxacin in the tissues of Larimichthys crocea during 0-24 h after intramuscular injection.

2.3 殘留消除規(guī)律

恩諾沙星含量在大黃魚體內(nèi)達到最大值后，在給藥后的前48小時下降明顯，血漿中的恩諾沙星質(zhì)量濃度從最高的41.5 mg/L降至2.32 mg/L；肌肉、肝臟、性腺中的恩諾沙星含量分別從最高的108、 68.8、 22.5 mg/kg降至8.25、 5.18、 4.53 mg/kg，之后藥物濃度保持穩(wěn)定下降，但消除速度明顯變慢，一直到給藥后的第60天，恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中均可檢出，濃度分別為5.58×10-3mg/L、1.62×10-2mg/kg、2.25×10-2mg/kg、3.93×10-2mg/kg。如表4所示，恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的消除半衰期分別為30.484、 51.971、 47.823、 69.315 h。

恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)僅有少部分代謝成環(huán)丙沙星，因此環(huán)丙沙星濃度較恩諾沙星低很多。血漿中的環(huán)丙沙星在給藥后1 h質(zhì)量濃度達到最大值0.693 mg/L，之后下降迅速，給藥9 d后，血漿中的環(huán)丙沙星再未檢出。環(huán)丙沙星在給藥后的前96小時，肌肉、肝臟、性腺中的環(huán)丙沙星含量下降較快，分別從最高的0.579、 3.96、 1.11 mg/kg降至8.12×10-2、 8.58×10-2、 9.76×10-2mg/kg，之后消除速率變慢。直至在給藥后的第30天，肌肉中的環(huán)丙沙星仍可檢出，含量為1.68×10-3mg/kg。

對環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的藥物濃度達到最大值之后的濃度-時間數(shù)據(jù)用Excel軟件進行擬合，得到環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除曲線方程，如表5所示，其消除半衰期分別為28.88、 57.75、 43.31、 40.76 h。

表5 環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的消除曲線方程及參數(shù)Tab.5 Elimination curve equation and parameters of Ciprofloxacin in Larimichthys crocea mg·kg-1, n=5

2.4 理論休藥期

中國農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定恩諾沙星在水產(chǎn)動物肌肉中的最大殘留限量(MRL)為100 μg/kg。以肌肉作為靶組織，根據(jù)恩諾沙星在大黃魚肌肉中的藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，用Excel軟件進行擬合，得到恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除曲線方程為：C=0.245 1e-0.002t，相關系數(shù)R2=0.863。通過休藥期公式計算得到休藥期為448.3 h，即18.7 d。

3 討論

3.1 恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的藥動學特征

本研究結果顯示，在肌注給藥方式下，恩諾沙星在大黃魚血漿中的藥物代謝動力學過程符合二室開放模型。這與恩諾沙星在大菱鲆[5]、鰻鱺[9]、鱘[12]、黑裙[13]等魚體內(nèi)的代謝模型相似。

達峰時間Tmax和峰濃度Cmax是反映藥物在體內(nèi)吸收快慢的重要指標。本實驗條件下，大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺Tmax分別為0.170、 0.500、 1.000、 1.000 h，Cmax分別為41.500 mg/L、 107.800 mg/kg、 68.835 mg/kg、 22.458 mg/kg。這說明恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)吸收較快，其中在血漿中吸收最快，其次為肌肉。同為肌注給藥方式，大黃魚血藥達峰時間小于大菱鲆(0.5 h)[5]、異育銀鯽(0.75 h)[15]、烏鱧(2 h)[11]，大于擬穴青蟹(0.017 h)[19]、中華絨螯蟹(0.083 h)[22]、羅氏沼蝦(0.083 h)[18]。這說明在肌注給藥方式下，大黃魚恩諾沙星吸收速率大于大菱鲆、異育銀鯽和烏鱧，小于擬穴青蟹、中華絨螯蟹和羅氏沼蝦。

分布半衰期T1/2α、表觀曲線下面積AUC和表觀分布容積V1/F是反映藥物在體內(nèi)分布的主要藥動學參數(shù)。本實驗條件下，大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺T1/2α分別為1.085、 12.579、 7.155、 18.642 h，V1/F分別為1.782、 0.712、 1.882、 2.115 L/kg。AUC較大，說明恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)分布廣泛，可以起到很好的殺菌作用。在肌注給藥方式下，大黃魚血漿T1/2α與大菱鲆(0.987 h)[5]相近，小于異育銀鯽(4.925 h)[15]，大于中華絨螯蟹(0.580 h)[22]和羅氏沼蝦(0.581 h)[18]。

消除半衰期T1/2β和清除率CL/F是反映藥物在體內(nèi)消除快慢的主要藥動學參數(shù)。本實驗條件下，大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺T1/2β分別為30.484、 51.971、 47.823、 69.315 h，CL/F分別為0.210、 0.033、 0.080、 0.072 L/(h·kg)，這說明恩諾沙星在血漿中消除的最快。在肌注給藥方式下，大黃魚血漿T1/2β小于大菱鲆(68.003 h)[5]、擬穴青蟹(57.02 h)[19]、中華絨螯蟹(83.833 h)[22]、羅氏沼蝦(69.315 h)[18]，大于異育銀鯽(9.292 h)[15]。大黃魚血漿CL/F與雜交鱘[0.228 8 L/(h·kg)][12]較為接近，大于歐洲鰻鱺[0.074 L/(h·kg)][9]和牙鲆[0.083 L/(h·kg)][24]。這說明大黃魚消除速率與雜交鱘接近，大于大菱鲆、牙鲆、歐洲鰻鱺、擬穴青蟹、中華絨螯蟹和羅氏沼蝦，小于異育銀鯽。

由上可見，在肌注給藥方式下，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)總體吸收、分布和消除較快。

喹諾酮類藥物對常見細菌的治療效果通常與藥動學和藥效學參數(shù)有關。一般認為，當血漿中藥物的峰濃度(Cmax)與最低抑菌濃度(MIC)的比值達到10以上時，即可起到良好的治療效果，并且當Cmax/ MIC=10時，效果最佳[25-26]。馬寅等[27]測得恩諾沙星對溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、最小弧菌(V.mimicus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等4種常見的水產(chǎn)治病弧菌的MIC為0.1～0.8 mg/L，由此得到本實驗CmaxMIC為51.9 ～ 415。可見，在本實驗條件下，肌注恩諾沙星對大黃魚常見的細菌性疾病可以起到較好的治療效果。

為了保持一定的穩(wěn)態(tài)血藥濃度，徐叔云等[28]提出了穩(wěn)態(tài)血藥濃度Css的計算公式，見式(2)。

式(2)

式(2)中，Css為期望達到的穩(wěn)態(tài)血藥濃度；F為生物利用度；X0為每次給藥劑量；Vd為表觀分布容積；K10為藥物在中央室的消除速率；τ為給藥時間間隔。由表4可知，Vd=1.782 L/kg，K10=0.118 1/h。MIC按平均值0.45 mg/L計，Css按10倍MIC計，Css= 4.5 mg/L，F(xiàn)按80%計。結合消除半衰期T1/2β為30.484 h，建議一天給藥一次，τ=24 h。根據(jù)上述公式，得到X0=28.4 mg/kg。因此，對大黃魚可采取如下給藥方案：按魚體重每次肌注恩諾沙星28.4 mg/kg，一天一次，連續(xù)給藥2次。

3.2 恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的藥動學特征

環(huán)丙沙星為禁用藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中禁止使用，但本實驗中在大黃魚體內(nèi)檢出的環(huán)丙沙星并不是由直接肌注給藥產(chǎn)生的，而是恩諾沙星在代謝過程中產(chǎn)生的。此外，中國農(nóng)業(yè)部第235號公告中的恩諾沙星殘留限量為恩諾沙星和其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的總殘留量。因此，研究恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝動力學同樣具有重要意義。恩諾沙星有多種代謝途徑，最主要的是脫去乙基代謝成為環(huán)丙沙星，但其代謝程度存在種屬差異。王洪艷等[24]研究恩諾沙星在牙鲆體內(nèi)的代謝規(guī)律發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星在血液、肝臟和腎臟中均可檢出，但在肌肉中未檢出。Koc等[29]對褐鱒(Salmotrutta)進行靜脈注射和口灌恩諾沙星實驗，血漿中均未檢測到環(huán)丙沙星。在本研究中，環(huán)丙沙星在大黃魚血漿、肌肉、肝臟和性腺中均可檢出，但環(huán)丙沙星占恩諾沙星和環(huán)丙沙星總量的比值很低，絕大部分都在15%以下，其中血漿中的環(huán)丙沙星占比絕大部分都在5%以下。這說明恩諾沙星進入大黃魚體內(nèi)后，絕大部分以原藥形式存在，僅有少部分脫去乙基代謝為環(huán)丙沙星。

應用DAS 2.0 軟件對大黃魚體內(nèi)的環(huán)丙沙星濃度-時間數(shù)據(jù)進行房室模型分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝過程不符合一室和二室模型。環(huán)丙沙星在血漿中的最大質(zhì)量濃度為0.693 mg/L，在肝臟、肌肉和性腺中的最大含量分別為3.96、 0.579、 1.11 mg/kg。環(huán)丙沙星在肝臟、血漿、肌肉和性腺中的含量達到最大值的時間依次為1、 1、 24、 24 h。由此可以看出，肝臟中環(huán)丙沙星的最大含量明顯高于血漿、肌肉和性腺的最大含量，并且達到最大含量的時間明顯早于肌肉和性腺，這說明恩諾沙星是在肝臟中脫去乙基代謝成環(huán)丙沙星，然后通過血液循環(huán)輸送到大黃魚其他組織。在給藥后的前5天，環(huán)丙沙星在各組織中的含量首先上升，達到最大濃度后，其含量整體呈下降趨勢，但其間也會出現(xiàn)濃度上升和保持平穩(wěn)的現(xiàn)象，這可能是由于恩諾沙星在不斷代謝為環(huán)丙沙星的同時，環(huán)丙沙星自身也在不斷的進行代謝造成的。

3.3 恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)的殘留消除規(guī)律

大黃魚體內(nèi)的恩諾沙星含量在給藥后的前48小時下降明顯，這說明在給藥后的前48小時恩諾沙星消除較快，之后保持穩(wěn)定下降，但消除速率明顯變慢。恩諾沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的消除半衰期分別為30.484、 51.971、 47.823、 69.315 h，由此可見，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)整體消除較快，但在不同組織中存在一定的差異，消除速率由大到小依次是血漿、肝臟、肌肉和性腺。

恩諾沙星進入大黃魚體內(nèi)后，僅有少部分代謝成環(huán)丙沙星。在給藥后的前96 小時，環(huán)丙沙星濃度下降速度較快，之后消除速率變慢。由環(huán)丙沙星消除曲線方程得到環(huán)丙沙星在血漿、肌肉、肝臟和性腺中的消除半衰期分別為28.88、 57.75、 43.31、 40.76 h。由此可知，環(huán)丙沙星在大黃魚體內(nèi)整體消除較快，但在不同組織中存在一定的差異，其中在血漿中消除的最快，在肌肉中消除的最慢。

3.4 休藥期的確定

休藥期是根據(jù)食用組織中藥物的允許殘留量和藥物的消除速率來確定的。中國農(nóng)業(yè)部第235號公告規(guī)定恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星總殘留量在水產(chǎn)動物肌肉中不得超過100 μg/kg。藥物消除速率在實際養(yǎng)殖中則受多種因素的影響，主要包括水產(chǎn)動物的種屬、規(guī)格、養(yǎng)殖水溫、給藥劑量、給藥方式、水質(zhì)狀況、光照條件等[30]。本實驗于2016年12月至2017年2月進行，實驗大黃魚規(guī)格為200～300 g，對大黃魚進行恩諾沙星肌注給藥，給藥水平為50 mg/kg，給藥后進行正常飼養(yǎng)，在整個實驗過程中，養(yǎng)殖池水溫從23 ℃逐漸下降至17 ℃，在此實驗條件下，以肌肉作為靶組織，根據(jù)休藥期公式，計算得到恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的休藥期為18.7 d。因此，在本實驗條件下，建議休藥期不低于19 d。與本實驗采取肌注給藥方式研究恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的代謝動力學不同，大多數(shù)研究者采取的是口灌和投喂給藥方式。李娜等[6]在11～12 ℃水溫條件下，以30 mg/kg的劑量對大菱鲆連續(xù)口服恩諾沙星7 d，每天2次，在停藥后的第94天，恩諾沙星殘留量仍超過限量標準。常志強等[7]在20 ℃水溫條件下，以30 mg/kg劑量的恩諾沙星對大菱鲆、牙鲆和半滑舌鰨連續(xù)進行灌胃3 d，得到大菱鲆、牙鲆和半滑舌鰨的休藥期分別為44、 33、 47 d。郭嬌嬌等[12]以10 mg/kg的劑量對雜交鱘單次口灌給藥，得到恩諾沙星在雜交鱘中的休藥期至少為20 d。李佳蔚等[13]在18 ℃水溫條件下，以20 mg/kg的劑量對黑裙單次灌服給藥，得到黑裙的休藥期至少為35 d。徐維海等[14]以50 mg/kg的劑量對吉富羅非魚和中國對蝦連續(xù)投喂7 d，得到吉富羅非魚的休藥期為22 d，中國對蝦的休藥期為12 d。余開等[20]以10 mg/kg的劑量對三疣梭子蟹口灌給藥，得到三疣梭子蟹的休藥期為14 d。由此可見，在不同的實驗條件下，得到的恩諾沙星休藥期數(shù)據(jù)均存在一定的差異。這說明休藥期與水產(chǎn)動物的種屬、給藥方式、給藥劑量以及養(yǎng)殖水溫等密切相關。本實驗采取肌注給藥方式進行研究，可以精確控制每一個實驗個體的藥物注射劑量，因此能更準確地考察藥物的代謝情況。口灌給藥操作難度較大，在實際生產(chǎn)中無法廣泛采用；投喂給藥與實際生產(chǎn)較為接近，但存在部分藥物易擴散到水體中，并且由于個體進食量的差異，無法準確獲得單個個體的實際給藥量。梁俊平等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在肌注給藥條件下，恩諾沙星的吸收和消除均快于口服給藥，并且比口服給藥吸收完全。因此，盡管本研究與實際生產(chǎn)存在一定差異，但仍可以為在大黃魚實際生產(chǎn)過程中科學使用恩諾沙星提供參考。

4 結論

在(20±3)℃水溫條件下，以50 mg/kg恩諾沙星肌注大黃魚后，恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)吸收、分布迅速，消除較快。以肌肉作為靶組織，根據(jù)休藥期公式，計算得到恩諾沙星在大黃魚體內(nèi)的休藥期為18.7 d。因此，在本實驗條件下，建議休藥期不低于19 d。該研究結果可為大黃魚在實際養(yǎng)殖過程中科學使用恩諾沙星提供參考。

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