超高效液色譜相法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留

侯耀杰

（甘肅省獸藥飼料監(jiān)察所，甘肅 蘭州 730030）

氟喹諾酮類藥物是一種廣譜抗生素，具有高效、低毒等特點(diǎn)，常用于動(dòng)物飼料中，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，降低動(dòng)物發(fā)病率[1]。因其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用，容易在動(dòng)物性食品中造成藥物殘留，而長(zhǎng)期食用具有抗生素殘留的動(dòng)物性食品，容易引起許多問題，嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)造成危害，甚至致癌[2-3]。

目前，雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)主要通過高效液相法、液質(zhì)法等，液相法操作簡(jiǎn)便有效，但傳統(tǒng)的常規(guī)液相法通常耗時(shí)較多，工作效率低，隨著超高效液相色譜在檢測(cè)工作中的廣泛應(yīng)用，工作效率得到了極大的提高。本文中使用甲酸乙腈對(duì)樣品進(jìn)行提取，經(jīng)超高效液相法分析，對(duì)超高效液相法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的結(jié)果進(jìn)行匯總分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 超高效液相色譜儀Agilent 1290，電子天平PL402-L，電子天平AV412，高速冷凍離心機(jī)Bilguge stratos等。

1.2 試劑 乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），甲酸（Fisher）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 環(huán)丙沙星 （中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，99.8%），恩諾沙星 （中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，99.9%），沙拉沙星 （中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，99.6%），達(dá)氟沙星(QCC，99.6%）。

2 方法

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液：乙腈（V/V）=82:18；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280nm,發(fā)射波長(zhǎng) 450nm；流速：0.3ml/min；進(jìn)樣體積：5μl； 色譜柱型號(hào)：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱,1.8μm,2.1×150mm。

2.2 提取 取雞蛋，打碎去殼攪勻，稱取2.00g，置于50ml離心管中，加入8ml 1%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻，振蕩 5min，10000r/min離心 5min，將上清液轉(zhuǎn)移入50ml離心管中。樣品殘?jiān)屑?ml 1%甲酸乙腈溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。提取液于40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，離心管中加4ml流動(dòng)相，渦旋溶解，溶液轉(zhuǎn)入15ml離心管中，12000r/min離心5min，取上清液，過 0.2μm微孔濾膜，供超高效液相色譜檢測(cè)分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解配制成1mg/ml的儲(chǔ)備液，量取適當(dāng)儲(chǔ)備液，以流動(dòng)相稀釋成含有環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星 1μg/ml和達(dá)氟沙星 0.2μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

適當(dāng)量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相分別稀釋成含有環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星（5、25、50、100、500ng/ml) 和含有達(dá)氟沙星（1、5、10、20、100ng/ml）的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測(cè)定后以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液中各組分的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度 在空白雞蛋樣品中添加不同濃度的氟喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液，做添加回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度為 10（達(dá)氟沙星 2μg/kg）、100（達(dá)氟沙星 20μg/kg）、200μg/kg （達(dá)氟沙星 40μg/kg），每個(gè)濃度做五個(gè)平行樣品，重復(fù)三次，計(jì)算回收率和批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 結(jié)果與討論

3.1 氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)，常規(guī)高效液相法使用250nm×4.6nm的C18色譜柱，流動(dòng)相使用磷酸三乙胺-乙腈，但由于超高效液相的色譜柱短，粒徑細(xì)，且氟喹諾酮類藥物屬于兩性化合物，結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有羧基和可質(zhì)子化的氮，因此在使用相同的流動(dòng)相時(shí)，四種不同的藥物不能夠得到有效分離。后使用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，四種藥物得到分離并且峰形良好。高效液相法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物大約需要20min，而超高效液相在6.5min之內(nèi)就能夠完成分析，很大程度上節(jié)省了時(shí)間，提高了工作效率。超高效液相法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)液圖譜和陽性添加圖譜見圖1、圖2。

圖1 氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)液圖譜

圖2 氟喹諾硐類藥物的陽性添加圖譜

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在1～500ng/ml范圍內(nèi)，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星和沙拉沙星各自的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.9999。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖3。

圖3 氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 在實(shí)驗(yàn)過程中，依照農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-6-2006方法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，四種氟喹諾酮類藥物的回收率不夠理想，使用1%的甲酸乙腈溶液提取，在空白試料中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，環(huán)丙沙星回收率范圍是76.5%～99.1%，恩諾沙星回收率范圍是73.4%～96.7%，達(dá)氟沙星回收率范圍是79.5%～97.4%，沙拉沙星回收率范圍是77.5%～98.9%，批內(nèi)、批間RSD均小于10.0%，符合檢測(cè)要求。結(jié)果見表1。

表1 雞蛋中氟喹諾酮類藥物添加回收結(jié)果統(tǒng)計(jì)

4 結(jié)論

超高效液相法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，較普通高效液相法檢測(cè)方法更為簡(jiǎn)便快捷。以此方法檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類藥物，前處理過程簡(jiǎn)單，使用試劑較少，且超高效液相檢測(cè)靈敏度更高，分析時(shí)間較短，同時(shí)，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，因此，該方法適用于雞蛋中氟喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)。

[1] 李丹,張玉潔,仲 鋒,等.雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測(cè)方法研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,44(6):1-4.

[2] 楊衛(wèi)軍,李 曼,曹秀梅,等.超高效液相色譜法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留 [J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2016,(4):8-12.

[3] 董艷峰,于靜泉,張 巍.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定雞肝中五種氟喹諾酮類藥物殘留 [J].中國獸醫(yī)雜志,2010,44(6):5-8.