基于ISSR標(biāo)記的油茶種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)分析

姜德志+方應(yīng)有+肖賢

摘要：以油茶（Camellia oleifera Abel.）主產(chǎn)區(qū)的109個(gè)種質(zhì)材料為試材，采用簡單序列重復(fù)區(qū)間分子標(biāo)記（ISSR）和非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析，研究了這109個(gè)油茶種質(zhì)材料遺傳相似系數(shù)及親緣關(guān)系分析，并構(gòu)建了其進(jìn)化樹關(guān)系。結(jié)果表明，①從49條ISSR引物中篩選出23條能夠擴(kuò)增出清晰，穩(wěn)定條帶的引物，23條引物共擴(kuò)增出487條帶，其中多態(tài)性條帶有335條，多態(tài)性條帶比率為68.79%；②應(yīng)用NTSYS2.10e軟件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行UPGMA法聚類分析，109個(gè)油茶種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)從0.61到0.93；③油茶種質(zhì)資源豐富，遺傳相似系數(shù)在0.735時(shí)，可將109個(gè)油茶種質(zhì)材料劃分為11個(gè)類群。類群I包括79個(gè)種質(zhì)材料，該類群在相似系數(shù)為0.75處又可劃分為7個(gè)亞類群，且這些油茶種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系較近。但由聚類分析劃分的油茶類群來看，這些油茶材料的遺傳背景又比較復(fù)雜，具有豐富的遺傳多樣性。分析結(jié)果可為油茶主產(chǎn)區(qū)的品種資源開發(fā)、基因資源保存、后期品種審定及鑒別提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：油茶（Camellia oleifera Abel.）；種質(zhì)資源；簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S794.4+95：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）02-0119-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.030

Abstract： 109 germplasm materials of Camellia oleifera Abel in the main producing areas were analyzed using inter simple sequence repeat markers（ISSR） and Unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis method to study the genetic correlation coefficient and genetic relationship， and constructe the phylogenetic relationship. The result showed that， （1） 23 primers with clear and stable bands were screened from 49 ISSR primers， and 487 bands were amplified by the 23 primers， of which 335 bands were polymorphic，and the polymorphic bands ratio was 68.79%.（2） NTSYS2.10e software was used to cluster the amplified results by UPGMA method； and the genetic similarity coefficients of 109 C. oleifera germplasm materials were from 0.61 to 0.93. （3） The germplasm resources of C. oleifera were rich. When the genetic similarity coefficient was 0.735， the 109 C. oleifera germplasm materials could be divided into 11 groups. The group I includes 79 germplasm materials， which can be divided into 7 sub groups at the similarity coefficient of 0.75， and the genetic relationship among these C. oleifera germplasm materials is closer. However， the genetic background of these C. oleifera germplasm materials is complex and rich in genetic diversity. The analysis results can provide theoretical basis for germplasm resources development， genetic resources conservation， late variety certification and identification in C. oleifera major producing areas.

Key words： Camellia oleifera Abel.； germplasm accessions； inter simple sequence repeat； genetic diversity

油茶（Camellia oleifera Abel.）為山茶科（Theacea）山茶屬（Camellia L.）植物[1]，是適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛的木本油料樹種，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)價(jià)值[2]。中國油茶種質(zhì)資源極為豐富，各油茶產(chǎn)區(qū)都選育出了大量的優(yōu)良單株、無性系和家系，全國共選出 200多個(gè)優(yōu)良無性系[3]。但是由于遺傳背景與環(huán)境的影響，眾多無性系的形態(tài)特征出現(xiàn)了較大差異，導(dǎo)致油茶品種名稱混亂，同名異物、同物異名的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[4]。因此，從分子水平上對(duì)油茶品種及新選育品系進(jìn)行種群關(guān)系鑒別十分必要。現(xiàn)在分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展快速，其在油茶研究中的應(yīng)用也越來越廣泛[5]。簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記（Inter simple sequence repeat，ISSR）是類似隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，是近幾年在微衛(wèi)星分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[6]。利用ISSR技術(shù)能夠檢測出較多的DNA多態(tài)性[7]。ISSR標(biāo)記能有效揭示種群內(nèi)的遺傳多樣性，進(jìn)而分析其系統(tǒng)分化規(guī)律，研究群體遺傳結(jié)構(gòu)及其多樣性程度[8]。ISSR技術(shù)極易受模板，引物以及Taq酶等因素的影響，任何一個(gè)因素的改變都可能使擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生變化[9]。因此需要對(duì)油茶ISSR分子標(biāo)記的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，才能使得到的結(jié)果更加精準(zhǔn)。試驗(yàn)選用ISSR技術(shù)探討國內(nèi)的油茶種質(zhì)資源遺傳相似性，以湖北省林業(yè)科學(xué)研究院油茶種質(zhì)資源基地保存的油茶種質(zhì)材料葉片為供試材料，旨在更快速、準(zhǔn)確、簡便的鑒定這些材料間的親緣關(guān)系，從分子水平上為湖北省油茶種質(zhì)資源的收集、鑒定和發(fā)展提供參考依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為在全國油茶主產(chǎn)區(qū)采集的油茶種質(zhì)材料，包括品種、優(yōu)樹等，共109個(gè)樣品，各材料樣品編號(hào)見表1。每個(gè)樣品隨機(jī)選取10～20片幼嫩葉片，采摘后裝入做好標(biāo)記的自封袋中，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.1.2 主要試劑 CTAB提取DNA試劑、30%聚丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛、無水乙醇、冰醋酸、親和硅烷、剝離硅烷等購自武漢宏博生物有限公司；瓊脂糖、5×TBE緩沖液、2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司；Maker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油茶基因組DNA的提取與檢測 參考楊翠芳等[10]和闕生全等[11]的CTAB法，略做改進(jìn)，提取109個(gè)油茶種質(zhì)材料葉片的總基因組DNA。于0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，檢測所提基因組DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，提取的總DNA保存于-20 ℃冰箱，備用，-4 ℃為短期存放條件。

1.2.2 引物來源及ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立 試驗(yàn)所用引物是依據(jù)油茶的EST文庫篩選出的ISSR序列，參照加拿大哥倫比亞大學(xué)網(wǎng)站公布的ISSR引物序列，共設(shè)計(jì)出49條擴(kuò)增引物（SSR1～SSR49），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系設(shè)為20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix反應(yīng)液（Tag Polymerase 0.1 U/μL、500 μmol dNTP each、20 mmol Tris-HCl、100 mmol KCl、3 mmol MgCl2及其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑）10 μL、引物2 μL、DNA模板50 ng、ddH2O 6 μL。擴(kuò)增程序設(shè)為94 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃變性30 s，50～56 ℃退火40 s，72 ℃ 3 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min[12]。

1.2.3 引物篩選 選用基因組DNA純度較高的油茶樣品為模板，分別對(duì)49個(gè)引物采用以上擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物先用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，再用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步分析，篩選出的多態(tài)性較高的引物用于109個(gè)油茶樣品的鑒定[9]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將選擴(kuò)的PCR產(chǎn)物全部上樣6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，在30 V/cm電壓下電泳約90 min，經(jīng)硝酸銀染色，氫氧化鈉顯影，所獲得的擴(kuò)增條帶以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫。同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性[13]。條帶統(tǒng)計(jì)以其清晰可重復(fù)為基本原則，采用人工讀帶法，在相同遷移位置上，有帶的記為1，無帶的記為0。在NTSYS 2.10e分析軟件中，根據(jù)SM相似系數(shù)法求得油茶種質(zhì)材料間的遺傳相似性矩陣，再用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)聚類分析樹狀圖[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

試驗(yàn)隨機(jī)選取油茶2個(gè)種質(zhì)材料AH18和XL51的DNA為模板，分別對(duì)49條ISSR擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選，淘汰無擴(kuò)增產(chǎn)物和多態(tài)性差的引物，選留擴(kuò)增條帶清晰且有明顯多態(tài)性片段的引物，結(jié)果見圖1、圖2。從圖1、圖2可見，在引物SSR8、SSR9、SSR13、SSR14、SSR15、SSR16、SSR17、SSR18、SSR20、SSR25、SSR30、SSR32、SSR36、 SSR38、 SSR43、 SSR45中均有多態(tài)性條帶，說明對(duì)應(yīng)編號(hào)的引物都可為ISSR引物篩選提供參考。而對(duì)其他泳道沒有顯示多態(tài)性條帶的引物予以淘汰。結(jié)合聚丙烯酰胺電泳進(jìn)一步分析，結(jié)果見圖2。從圖2可見，引物SSR7、SSR8、 SSR9、 SSR13、 SSR14、 SSR19、 SSR20、 SSR21、SSR28、SSR29、SSR32、SSR33、SSR34、SSR36的多態(tài)性條帶數(shù)清晰，再結(jié)合圖1初步篩選的結(jié)果，確定23條引物（表2）用于109個(gè)油茶種質(zhì)材料的認(rèn)證和鑒定。這些引物均能在供試油茶樣品中擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶。

2.2 ISSR多態(tài)性分析及指紋分析

用篩選出的23個(gè)引物分別對(duì)109個(gè)油茶種質(zhì)材料提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出487條DNA條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出21.2個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶有335條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出14.6個(gè)多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率為68.79%，具體見表2。從表2可見，不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)有較大差異，引物ISSR13，ISSR36擴(kuò)增出的條帶較多，分別為27、28條；引物ISSR9，ISSR10擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，均為16條。引物ISSR18、ISSR28和ISSR36擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最多，均為20條。用這23條引物分別建立了相應(yīng)的DNA指紋圖譜，限于篇幅，這里用引物SSR36的擴(kuò)增結(jié)果圖3、圖4作為代表來分析之，其引物擴(kuò)增效果所反映出的DNA條帶多態(tài)性可較好地區(qū)分各油茶種質(zhì)材料。

2.3 油茶品種間的遺傳相似性分析

用NTSYS2.10e軟件計(jì)算油茶種質(zhì)材料間的Dice遺傳相似系數(shù)，結(jié)果見表3（因篇幅關(guān)系，省略了一部分附表，僅以表3為例）。由表3可知，109個(gè)油茶種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)在0.61～0.93，平均遺傳相似性系數(shù)為0.74。以59號(hào)樣品（S13）和60號(hào)樣品（S12）的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.93，說明這2個(gè)樣品的親緣關(guān)系很近，有可能為同一品種。其次是4號(hào)樣品（贛無16）和6號(hào)樣品（贛無2號(hào)），相似性系數(shù)為0.87，表明它們之間的親緣關(guān)系很接近，遺傳差異較小。而14號(hào)樣品（XL53）與15號(hào)樣品（湘林210）具有最小遺傳相似性系數(shù)，為0.61，可見它們遺傳差異較大，2個(gè)樣品間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。endprint

2.4 聚類分析

在獲得兩兩不同樣品間的Dice遺傳相似系數(shù)基礎(chǔ)上，以487個(gè)位點(diǎn)的譜帶為原矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建了油茶種質(zhì)材料間的遺傳關(guān)系聚類圖譜，具體見圖5。在圖5聚類分析樹狀結(jié)構(gòu)中，可以看到109個(gè)油茶種質(zhì)材料的分類情況。樹狀圖與種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)反映的情況基本一致，即遺傳相似系數(shù)越高，親緣關(guān)系越近，種質(zhì)材料間差異就越小。109份種質(zhì)材料間的相似系數(shù)在0.70～0.93，表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性。

根據(jù)油茶ISSR聚類分析結(jié)果，說明親緣關(guān)系樹狀圖較復(fù)雜，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.70時(shí)，109個(gè)種質(zhì)材料可分為A、B兩組，B組中15號(hào)樣品湘林210可單獨(dú)聚類，說明該種質(zhì)材料與其他種質(zhì)材料間存在遺傳差異。

當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.735時(shí)，可將油茶種質(zhì)材料劃分為11個(gè)類群。類群I包括的樣品材料較多，有79個(gè)。該類群在相似系數(shù)為0.75處又可以劃分為7個(gè)亞類群。其中亞類群I-1包括14個(gè)種質(zhì)材料，該亞類群又可分為兩個(gè)小組，第二小組聚類了6個(gè)種質(zhì)材料，其中有4個(gè)是QY系列的；第一小組聚類了8個(gè)種質(zhì)材料，其中來自S系列的59號(hào)和60號(hào)樣品的遺傳相似性系數(shù)最大，為0.93，說明這兩個(gè)種質(zhì)材料的親緣關(guān)系很近，有可能為同一品種。亞類群I-2包括27個(gè)樣品，有7個(gè)是贛系列的。亞類群I-3包括4個(gè)種質(zhì)材料，來自贛無系列的4號(hào)和6號(hào)樣品聚類在一起，遺傳相似系數(shù)為0.87，說明他們的親緣關(guān)系接近，遺傳差異較小。亞類群I-4包括湘林7、XL32、QY235、AH12、長林3、QY104這6個(gè)種質(zhì)材料。亞類群I-5包括24個(gè)樣品，其中有8個(gè)來自贛系列。亞類群I-6只有來自S系列的S8和S6兩個(gè)樣品。亞類群I-7只有XLC25和AH19兩個(gè)樣品。

類群Ⅱ包括5個(gè)種質(zhì)材料。類群Ⅲ包括4個(gè)種質(zhì)材料，其中有3個(gè)是贛系列的。類群Ⅳ包括3個(gè)種質(zhì)材料，其中有2個(gè)來自贛系列。類群Ⅴ、類群Ⅵ和類群Ⅶ均包括3個(gè)種質(zhì)材料。而類群Ⅷ和類群Ⅸ分別只有S3、茶花各1個(gè)樣品。類群Ⅹ包括6個(gè)樣品，其中有5個(gè)樣品是XL系列的。類群Ⅺ則只有湘林210這一個(gè)樣品。

3 討論

3.1 ISSR標(biāo)記和引物篩選

遺傳標(biāo)記是作物遺傳育種研究的重要工具之一，ISSR以其設(shè)備技術(shù)簡單、重復(fù)性高、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)已在果樹起源進(jìn)化及系統(tǒng)分類研究方面發(fā)揮著重大作用[15]。試驗(yàn)中由49對(duì)引物最終僅篩選出23對(duì)多態(tài)性高的引物，篩選效率一般，引物篩選率為46.9%，可能來自兩方面的原因，一是EST數(shù)據(jù)較少，來源單一，所設(shè)計(jì)的引物本身就存在較高的冗余度；二是中國油茶種質(zhì)材料之間親緣關(guān)系較近，不易得到有多態(tài)性的引物[16]。

3.2 遺傳多樣性分析

多態(tài)位點(diǎn)百分率是衡量物種遺傳變異水平高低的一個(gè)重要指標(biāo)，是衡量遺傳多樣性的重要參數(shù)[17]。張婷等[18]對(duì)湖北省5個(gè)地區(qū)的48個(gè)油茶資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，將湖北省主要油茶栽培品系分為兩大類群，恩施州的鶴峰居群為一類，其他地區(qū)居群為一類。

在親緣關(guān)系分析方面，Huang等[19]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)，用18條引物分析了90個(gè)油茶無性系的遺傳多樣性，結(jié)果擴(kuò)增譜帶中的多態(tài)性譜帶比率高達(dá)95.11%；彭方仁等[20]利用ISSR技術(shù)用10個(gè)引物對(duì)192份油茶種質(zhì)材料進(jìn)行了鑒別，結(jié)果多態(tài)性百分率為88.14%；代惠萍等[21]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，用11個(gè)引物對(duì)秦巴山區(qū)的32個(gè)油茶品種進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果多態(tài)性位點(diǎn)比率為60.28%；本試驗(yàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，用23個(gè)引物對(duì)109個(gè)油茶種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，所得到的多態(tài)性比率為68.79%，表明供試油茶種質(zhì)材料之間存在著較大程度的遺傳變異，具有豐富的遺傳多樣性。這與湖北省油茶種質(zhì)資源豐富、油茶分布地區(qū)廣及油茶長期的異花授粉造成的遺傳背景高度復(fù)雜等因素有關(guān)。

3.3 油茶親緣關(guān)系的聚類分析

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聚類分析中部分地理來源相同或遺傳背景相似的種質(zhì)材料能夠聚在同一類群里，但也有一些地理來源及遺傳背景不一致的種質(zhì)材料也能聚集在同一類群，顯示出了復(fù)雜的親緣關(guān)系?？赡艿脑蛞皇怯筒枰延杏凭玫脑耘鄽v史，在長期的生產(chǎn)中，各油茶產(chǎn)區(qū)遺傳資源在不斷交流所致[2]；二是種質(zhì)材料數(shù)量不均勻，此次采集的樣品中贛系列有24個(gè)，XL系列有20個(gè)，長林系列、S系列和AH系列均有10個(gè)，QY系列有9個(gè)，鄂油系列有8個(gè)，其他的更少，甚至有的系列只有1個(gè)，如華碩，這導(dǎo)致聚類結(jié)果的不規(guī)律；三是油茶具有異花授粉的特性，這導(dǎo)致了種質(zhì)材料高水平的遺傳多樣性[22]。

試驗(yàn)中，109個(gè)油茶種質(zhì)材料利用 ISSR分子標(biāo)記得到的聚類分析圖從總體上看似乎有點(diǎn)雜亂，這主要是由于樣品數(shù)量繁多所造成的；從單個(gè)的油茶品種（優(yōu)樹）系列來看，贛系列、XL系列、長林系列以及QY系列等能清晰地建立遺傳圖譜，鑒別其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。如贛系列中，聚類在亞類群I-3中的贛無16和贛無2號(hào)的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.87；贛無5、贛無11、贛興46、贛石84-8、贛無24、贛永6和贛無20的親緣關(guān)系較近，在亞類群I-2中聚在一起；贛無1、贛68、贛8、贛6、贛70、贛興48、贛190和贛石83-4的親緣關(guān)系較近，在亞類群I-5中聚在一起。又如XL系列中，XLC26、XLC4、XL36、XLC6和XLC8的親緣關(guān)系較近，在類群X中聚在一起；S系列中，S1、S6、S8、S10、S11、S12、S13和S17的親緣關(guān)系較近，在類群I中聚在一起，其中在亞類群I-1中的S13和S12的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.93。當(dāng)然，由于條帶判讀具有主觀性、某些條帶擴(kuò)增效果不明顯等原因會(huì)使鑒定結(jié)果可能存在偏差，這需要更多的試驗(yàn)來驗(yàn)證。

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