超高效液相色譜-四極桿線性離子阱質(zhì)譜法同時檢測石蒜屬3種生物堿

李青竹，張永春，鄭玉紅，楊柳燕，蔡友銘*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201106；2.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014)

石蒜屬(Lycorisspp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物，富含多種石蒜屬植物特有的生物堿成分[1-3]。迄今為止，從石蒜屬植物中分離出超過500種結(jié)構(gòu)各異的生物堿類化合物，植物化學研究表明，該類化合物具有多種藥理學功能，藥用價值極高。其中，加蘭他敏和力可拉敏可用于治療阿爾茨海默癥，石蒜堿在抗菌、抗瘧疾、治療腫瘤、抗病毒和保護心血管等方面具有重要價值[4-7]。野生的石蒜資源是藥用生物堿最重要的來源，因此，對石蒜中加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿的含量進行準確定性和定量分析是育種和生物堿類物質(zhì)合成代謝研究的重要內(nèi)容之一。

目前高效液相色譜[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[11-12]技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物重要代謝產(chǎn)物含量、中藥藥用成分、化妝品活性成分和農(nóng)產(chǎn)品藥物殘留的分析中。上述分析方法也被用于石蒜生物堿類物質(zhì)的檢測分析，如高效液相色譜檢測(HPLC)法[13-15]。Quan等[15]通過對比樣品與已知的標準品在相同條件下的保留時間和峰面積，進行了石蒜屬忽地笑中生物堿的定量研究，但植物樣本和試劑消耗極大，同時，其僅采用HPLC方法根據(jù)物質(zhì)的保留時間進行含量檢測，無法對待測物質(zhì)進行準確定性，因此物質(zhì)定量結(jié)果不可靠，不能進行結(jié)構(gòu)、定性和精確定量分析。Saliba等[16]采用HPLC-ESI-MS方法，對夏雪片蓮芽中的生物堿進行定量分析，采用梯度洗脫，梯度洗脫前期和后期需很長的分析時間，檢測程序時長為36 min，加蘭他敏的洗脫時間為33 min，石蒜堿的洗脫時間為25.5 min，且在定性定量準確性上仍有缺陷。上述兩種技術(shù)還存在提取時間長，操作繁瑣的問題，為生物堿類物質(zhì)的快速定量分析帶來不便。

本研究基于UPLC-QTRAP-MS/MS這一準確且應(yīng)用廣泛的定性定量方法[17-20]，建立了快速同時測定石蒜屬中12個種加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿的分析方法，通過二級質(zhì)譜提供的母離子和子離子信息監(jiān)測，能提高定性及定量分析的準確性，將為研究石蒜屬植物中生物堿的積累規(guī)律和合成代謝調(diào)控提供快速、有效且準確的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀Nexera UHPLC LC-30A(日本島津公司)，配Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)液相色譜柱；Qtrap 5500質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)，配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.6.2工作站； SB-5200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司，超聲功率200 W，40 kHz) ; BS210S型電子分析天平(萬分之一，北京賽多利斯天平有限公司)；標準品溴氫加蘭他敏購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度>98%，力可拉敏和石蒜堿標準品均購自上海安譜實驗科技股份有限公司，純度>98%，實驗用水為Millipore純水器制備的超純水，乙醇、甲醇和乙腈為色譜純(德國默克公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

1.2.1標準溶液的制備稱取適量加蘭他敏、力可拉敏、石蒜堿標準品各0.010 g，分別用甲醇溶解并定容至100 mL，得到上述3種物質(zhì)的標準儲備液(質(zhì)量濃度均為100 mg/L)。

標準中間液：分別準確移取1 mL上述標準儲備液置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容配成1.0 mg/L的混合標準中間液；標準工作液：根據(jù)需要移取適量混合標準中間液，分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、100、500 μg/L的標準工作溶液。

1.2.2材料與樣品制備方法供試石蒜屬植物材料由江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)提供，在上海市農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源圃保存種植，由南京林業(yè)大學王良桂教授指導采集，并由江蘇省中國科學院植物研究所鄭玉紅鑒定，憑證標本編號如下：長筒石蒜(Lycorislongituba,0653969)、香石蒜(Lycorisincarnata,0653959)、換錦花(Lycorissprengeri,0653967)、石蒜(Lycorisradiata,0653965)、忽地笑(Lycorisaurea,0653958)、紅藍石蒜(Lycorishaywardii,0653964)、矮小石蒜(Lycorisradiatavar.pumila,0653966)、中國石蒜(Lycorischinensis,0653960)、稻草石蒜(Lycorisstraminea,0646254)、鹿蔥(Lycorissquamigera,0653962)、陜西石蒜(Lycorisshaanxiensis,726057)和乳白石蒜(Lycorisalbiflora,0653963)，憑證標本存于江蘇省中國科學院植物研究所標本館。以鱗莖為待測樣品，取0.2 g鮮樣冷凍干燥后，研磨成粉，取石蒜鱗莖干樣0.02 g，置于EP管中加入2 mL 70%乙醇，超聲提取30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，濾渣加入2 mL 70%乙醇再次超聲提取30 min，渦旋1 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，合并兩次上清液，氮吹濃縮至近干，以1 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈(體積比95∶5)溶解，稀釋1 000倍至0.5～500 μg/L，過0.22 μm濾膜。

1.2.3含量計算將待測樣品的質(zhì)譜峰面積數(shù)據(jù)代入所得到的線性方程中，獲得待測樣品溶液中目標分析物的質(zhì)量濃度C(μg/L)，再根據(jù)復(fù)溶的溶劑體積V(mL)，稀釋倍數(shù)D，以及樣品質(zhì)量M(干重，單位為g)，計算樣品中目標分析物的含量m(單位為ng/g干重)，含量計算公式為：m=(C×V×D)/M。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件液相色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：50 ℃；進樣量：5 μL；流速為0.2 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件：0～3.5 min，95%A；3.5～4.5 min，95%～40%A；4.5～6 min，95%A。

1.3.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描及采集方式：正離子掃描下以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行分析；離子源噴霧電壓4 500 V；霧化氣Gas1：55；輔助氣Gas2：55；氣簾氣30。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等不同流動相的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動相時粘度小、傳質(zhì)快、柱壓低且目標物質(zhì)的保留時間更短，在乙腈中加入一定比例的甲酸可提高檢測的靈敏度、減少色譜峰拖尾，改善分析物的峰形，經(jīng)優(yōu)化選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

色譜分離樣品有梯度和等度洗脫2種方式，梯度洗脫適用于多種復(fù)雜成分的物質(zhì)分離，本研究同時檢測3種生物堿類物質(zhì)，等度洗脫無法實現(xiàn)物質(zhì)之間的有效分離，因此選擇梯度洗脫。在優(yōu)化的色譜條件下，加蘭他敏的保留時間為2.86 min，力可拉敏的保留時間為2.31 min，石蒜堿的保留時間為1.95 min。

在質(zhì)譜條件的優(yōu)化中，根據(jù)加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿的結(jié)構(gòu)并結(jié)合前人研究結(jié)果[16]，發(fā)現(xiàn)三者在正離子模式下具有較高的響應(yīng)和靈敏度及較清晰的質(zhì)譜圖，因此質(zhì)譜的離子化模式選擇正離子模式。3種物質(zhì)的提取離子色譜圖及MS/MS質(zhì)譜圖見圖1，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Optimized MS/MS parameters for the determination of Gal,Lycm and Lyc

2.2 供試品制備方法的優(yōu)化

對提取溶劑(50%、70%、90%乙醇)，超聲波提取時間(15、30 min)和二次提取方法進行考察(表2)，結(jié)果表明，采用70%乙醇作為溶劑，超聲波輔助提取2次，每次提取30 min具有較高的提取效率。

圖1 樣品的總離子流圖(A)及加蘭他敏(B)、力可拉敏(C)與石蒜堿(D)的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.1 TIC chromatogram of the extract from sample(A),and MS/MS spectrum of galanthamine(B),lycoramine(C)and lycorine(D)

SolventExtractiontime/minGalcontent/(μg·g-1DW)Lycmcontent/(μg·g-1DW)Lyccontent/(μg·g-1DW)50%Ethanol15390 1384 83932 350%Ethanol30417 2410 94164 570%Ethanol15436 5428 34302 170%Ethanol30464 9466 24515 690%Ethanol15413 4397 54200 690%Ethanol30436 3434 44389 7

DW：dry weight(干重)

2.3 方法學考察

2.3.1線性關(guān)系與檢出限按“1.2”方法進行標準溶液配制，在優(yōu)化實驗條件下采用本方法進行測定，以峰面積(Y)對相應(yīng)標準溶液濃度(X，μg/L)繪制標準曲線，得到線性方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍。以信噪比(S/N)為3確定儀器的檢出限(IDL)，以EPA定義的方法確定方法的檢出限(MDL)，結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，3種生物堿在0.5～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(r2>0.999)，以儀器在信噪比為3時能檢測到的最低濃度計算得IDL為0.1 μg/L。根據(jù)美國EPA對MDL認定方法，利用本文的分析步驟，對加標樣品進行 8次平行測定(加標濃度為預(yù)估檢出限的1～5倍)，結(jié)果經(jīng) Grubbs檢驗可以用于檢出限的計算，根據(jù)8個平行測定的標準偏差S和t分布值，利用公式MDL=t(8-1,0.99)×S確定該法測定Gal、Lycm、Lyc的MDL分別為0.34、0.25、0.25 μg/L。

表3 3種生物堿的線性回歸方程及檢出限Table 3 Linear regression equation,MDL and IDL of three types of alkaloids

2.3.2精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性取同一Gal、Lycm和Lyc標準品溶液，重復(fù)進樣5次，計算Gal、Lycm和Lyc峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.5%、0.79%、0.4%，說明儀器精密度較好。取同一樣品,按照“1.2”方法制備供試品溶液，進樣重復(fù)測定 5次,計算Gal、Lycm和Lyc含量的RSD分別為2.0%、3.4%、3.6%，說明方法重復(fù)性較好。取同一樣品溶液，分別在 0、3、6、9、24 h 進樣5次，測得Gal、Lycm和Lyc含量的RSD分別為3.4%、3.5%、3.0%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.3加標回收率實驗取已知含量的0.10 g干重樣品，精密稱定5份，加入一定量的標準品溶液，使供試品溶液中Gal、Lycm和Lyc的質(zhì)量濃度分別為25.00、10.00、40.00 mg/L，按“1.2”方法制備供試品溶液并進行測定，3種生物堿的平均回收率為97.2%～98.6%，RSD為0.8%～4.3%，表明該方法具有較好的準確度，可以用于樣品中3種生物堿的分析(見表4)。

表4 供試品溶液中3種生物堿的加標回收率與相對標準偏差(n=5)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of three types of alkaloids in test solutions(n=5)

2.4 石蒜屬12個種3種生物堿含量的測定

采用優(yōu)化的方法及條件，測定石蒜屬12個種3種生物堿的含量 (以干重計)，結(jié)果顯示，加蘭他敏的含量在石蒜屬不同種間差異可達 20倍，含量范圍為21.98～496.77 μg/g DW(表5)。加蘭他敏含量以長筒石蒜、忽地笑和中國石蒜較高，而紅藍石蒜、鹿蔥和矮小石蒜含量很低；石蒜堿含量以長筒石蒜、香石蒜和陜西石蒜較高，在鱗莖中的含量最高約為0.45%，除乳白石蒜較低外，種間差別約達45倍；力可拉敏含量以長筒石蒜、換錦花、紅藍石蒜較高，在鱗莖中的含量最高約為0.046%，除忽地笑、乳白石蒜和鹿蔥中極低外，種間差別約為38倍。

表5 石蒜屬3種生物堿的含量(n=5)Table 5 Three types of alkaloids contents in Lycoris spp.(n=5)

2.5 方法對比

本文建立了液相色譜-串聯(lián)二級質(zhì)譜檢測石蒜中3種生物堿的新方法，與傳統(tǒng)方法相比，本方法的樣品前處理具有操作簡單、有機溶劑消耗少、分析快速、分離效果好等特點。與已有文獻相比，如Saliba等[16]的方法主要提取步驟為：甲醇提取24 h、濃縮、硫酸酸化、氯仿抽提、蒸發(fā)、復(fù)溶、過濾，而本方法采取快速簡化的提取步驟，經(jīng)過2次超聲波輔助提取、離心、蒸發(fā)、復(fù)溶、過濾，提取過程快速簡單。Quan等[15]建立的HPLC方法中單次提取石蒜鱗莖材料需鮮樣20 g，甲醇110 mL，鹽酸10 mL，氯仿15 mL，對植物樣本和試劑消耗極大，本方法待測樣品鮮重可低至0.2 g，提取劑體積為2～5 mL。在保證提取效果的前提下，極大節(jié)約了植物材料和提取試劑。李明凱等[14]和Saliba等[16]的方法檢測程序長達30～50 min，而本方法的檢測程序時間≤6 min，3種物質(zhì)的洗脫時間<3 min，并且串聯(lián)了二級質(zhì)譜，分析了加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿子離子的信息，經(jīng)方法學確認，取得了很好的提取和分析效果，大大提高了分析速度和準確性。通過進一步的拓展研究，本方法可用于3種生物堿類物質(zhì)的提取和檢測，是一種簡捷、高效和準確的檢測方法。

3 結(jié) 論

本研究利用超聲波輔助進行二次提取，并以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為基礎(chǔ)，對石蒜屬植物中3種生物堿進行檢測，分析時間在6 min內(nèi)。通過對3種生物堿的保留時間、母離子、子離子的三級信息整合，特別是二級質(zhì)譜中多組母離子/子離子對的信息監(jiān)測，能確保定性和定量的準確性。此方法能快速提取并準確定性定量分析石蒜植物中的加蘭他敏、力可拉敏和石蒜堿，大幅縮短分析時間，提高分析準確度，為研究石蒜植物中上述生物堿類物質(zhì)的積累規(guī)律和合成代謝調(diào)控提供了有效且準確的分析方法。

[1] Zhu Z S，Xie S L.JiangxiForestSci.Technol.(朱重勝，謝樹祿.江西林業(yè)科技)，2008,5：41-42.

[2] Xie J，Tan F，F(xiàn)eng W，Chen B.Chin.Tradit.Herb.Drugs(謝峻,談鋒,馮巍,陳斌.中草藥)，2007,38(12)：1902-1905.

[3] Quan M H，Xia W J.Chin.J.Spectrosc.Lab.(全妙華,夏偉健.光譜實驗室)，2012,29(3):1800-1803.

[4] Yuan J H.Subtrop.PlantSci.(袁菊紅.亞熱帶植物科學)，2011,40(4)：1-7.

[5] Liu J,Hu W X,He L F,Ye M,Li Y.FEBSLett.,2004,578(3): 245-250.

[6] Sun C S，Zhu H，Peng Z J.Res.Pract.Chin.Med.(孫長生,朱虹,彭志金.現(xiàn)代中藥研究與實踐)，2011,6：30-31.

[7] Wang R,Xu S,Jiang Y M,Jiang J W,Li X D,Liang L J,He J,Peng F,Xia B.PlosOne,2013,8(4):e60449.

[8] Chen P J，Liang H，Xiao F，Lin L，Tu X K.J.Instrum.Anal.(陳沛金,梁宏,肖鋒,林黎,涂小珂.分析測試學報)，2017,36(3):403-408.

[9] Zhang W H,Xie W,Hou J B,Tong Y K,Lu S,Wang P.J.Instrum.Anal.(張文華,謝文,侯建波,童赟愷,陸順,汪鵬.分析測試學報)，2016,35(10):1241-1247.

[10] Zhu J G,Li P W,Zhang W,Sun X M,Yang Q Q,Zhang Q,Zhang Z W,Ding X X.J.Instrum.Anal.(朱建國,李培武,張文,孫曉曼,楊青青,張奇,張兆威,丁小霞.分析測試學報)，2016,35(9):1087-1093.

[11] Qin W H,Liu X,Yang Y,Zhang X M，Guo Y L,Liu F.J.Instrum.Anal.(秦偉瀚,劉翔,陽勇,張小梅,郭延壘,劉飛.分析測試學報)，2017,36(3):312-318.

[12] Qin Y,Yin J B,Du D S,Cao J,Yin C L,Cheng Z H.J.Instrum.Anal.(秦艷,尹建兵,杜冬生,曹捷,尹成樂,程志紅.分析測試學報)，2017,36(1):9-17.

[13] Li X，Xiong H R，Jiang L H，Wen Z Y，Xiong Y F.Chin.J.Appl.Chem.(李霞,熊海蓉,蔣利華,文祝友,熊遠福.應(yīng)用化學)，2010,27(11):1362-1364.

[14] Li M K，Zhang Y Q，Dong Z R，Gao C Y，Zhong Y L，Chen N，Wang M F.J.Instrum.Anal.(李明凱,張玉瓊,董召榮,高翠云,仲延龍,陳娜,王梅方.分析測試學報)，2012,31(8):957-961.

[15] Quan M H,Ou L J,She C W,Wu X J,Chen D M,Lu J T.Afr.J.Biotechnol.，2012,15: 3686-3691.

[16] Saliba S,Ptak A,Laurain-Mattar D.Eng.LifeSci.，2015,15:640-645.

[17] Liu J X，Luo Y Y，Liu X H，Song J P，Hua Y J，Wang S N.J.Chin.Mass.Spectral.Soc.(劉娟秀,羅益遠,劉訓紅,宋建平,華愉教,王勝男.質(zhì)譜學報)，2016，37(6):542-553.

[18] Zhu W X，Zhang L，Li S，Zhang L，Liu Y F，Yang J Z.Chin.J.Chromatogr.(祝偉霞,張莉,李睢,張麗,劉亞風,楊冀州.色譜)，2016，34(7):681-685.

[19] Li Q Z,Zhu F Y,Gao X,Sun Y,Li S,Tao Y,Lo C,Liu H.Planta，2014,240:701-712.

[20] Lam P Y,Liu H,Lo C.PlantPhysiol.，2015,168:1527-1536.