化學(xué)法和生物法制備巨菌草腐植酸的比較

尚校蘭，李宏宇，楊伊婷，梁菁菁(廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000)

腐植酸 (humic acid，HA) 是由動植物殘?bào)w經(jīng)過微生物的分解和合成以及地球化學(xué)的一系列過程形成的由芳香族及其多種官能團(tuán)構(gòu)成的天然有機(jī)高分子聚合物[1]。按照顏色和分子量不同，腐植酸可以分為黑腐酸、棕腐酸和黃腐酸[2]，其中黃腐酸的某些生物活性高于其他組分的腐植酸，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥、食品等方面有廣泛的應(yīng)用[3-5]。

腐植酸的形成有6種學(xué)說，糖胺縮合學(xué)說、多酚學(xué)說、起源于木質(zhì)素的多酚學(xué)說、木質(zhì)素學(xué)說、細(xì)胞自溶學(xué)說、微生物合成學(xué)說[6]。原生腐植酸屬于不可再生資源，因此尋找其他腐植酸的來源成了可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的迫切需求，于是生化腐植酸應(yīng)運(yùn)而生。目前，生化腐植酸主要由秸稈、蔗渣、木屑等工農(nóng)業(yè)廢棄物通過化學(xué)方法或生物發(fā)酵方法提取。呂品等[7]利用硝酸、乙酸提取了稻草中的腐植酸，腐植酸含量分別增加了19.29%和17.23%, 黃腐酸含量分別增加了32.91%和 22.89%；Plácido和Capareda[8]利用濃度分別為2.5%、5.0%和10.0%的KMnO4、H2SO4、NaOH于50 ℃ 24 h和120 ℃ 15倍大氣壓1 h處理棉花(Gossypiumspp.)廢棄物制備黃腐酸，發(fā)現(xiàn)低溫常壓長時(shí)下，各處理的黃腐酸含量從大到小依次為2.5% NaOH處理、10.0% NaOH處理、5.0% NaOH處理、10.0% H2SO4處理、5.0% H2SO4處理、2.5% H2SO4處理；高溫高壓短時(shí)下，黃腐酸含量從大到小依次為10.0% KMnO4處理、5.0% KMnO4處理、2.5% NaOH處理、5.0% NaOH處理、2.5% KMnO4處理、10.0% NaOH處理、2.5% H2SO4處理。曹均等[9]利用玉米(Zeamays)秸稈發(fā)酵制備腐植酸；姜愛莉[10]利用鋸末、玉米面和棉籽油進(jìn)行發(fā)酵，得到產(chǎn)物使用3.5% NaOH，于60 ℃下浸提1.5 h，黃腐酸的產(chǎn)率可達(dá)46.9%。

巨菌草(Pennisetumsp.)，隸屬被子植物門單子葉植物綱禾本科狼尾草屬。屬于多年生植物，直立叢生，植株高大，株高一般為3～5 m，最高可達(dá)8 m。利用巨菌草制備生化腐植酸的研究尚未見報(bào)道。本研究以巨菌草為原料，利用巨菌草纖維素、木質(zhì)素含量高的特點(diǎn)，通過化學(xué)方法及生物發(fā)酵方法制備其本身并不含有的生化腐植酸，為巨菌草資源化、產(chǎn)業(yè)化開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

巨菌草由福建農(nóng)林大學(xué)引種，于廊坊師范學(xué)院種植后采收烘干?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)、毛霉(Mucor)、根霉(Rhizopus)、青霉(Penicillium)由廊坊師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。分析用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

馬弗爐(YHG-9039A，上海姚式儀器設(shè)備廠)； 恒溫培養(yǎng)箱(YMJ-250F，上海姚式儀器設(shè)備廠)； 高壓滅菌鍋(YX-350Z，上海三申醫(yī)療器械有限公司)； 離心機(jī)(TD-10K，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1巨菌草處理

1)化學(xué)方法處理巨菌草 巨菌草粉碎烘干后，分別加入 90 mL不同濃度的乙酸(10.0%、20.0%、30.0%、40.0%、50.0%、60.0%、70.0%、80.0%、90.0%、100.0%)、草酸(2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%)、鹽酸(7.5%、15.0%、22.5%、30.0%、37.5%)、硝酸(12.5%、25.0%、37.5%、50.0%、62.5%)和氨水(5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%)，以蒸餾水為對照，加入反應(yīng)液后在室溫下攪拌均勻后，放入70 ℃水浴中反應(yīng)30 min，取出試樣在80 ℃下烘干，分別測定試樣的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、總腐植酸、黃腐酸的含量。

2)發(fā)酵方法處理巨菌草 稱取15 g粉碎的巨菌草加入90 mL蒸餾水搖晃均勻，滅菌。將培養(yǎng)成熟的毛霉、根霉、青霉、枯草芽孢桿菌分別接種到巨菌草溶液中培養(yǎng)，其中毛霉、根霉、青霉巨菌草溶液放入26 ℃培養(yǎng)箱中搖床發(fā)酵，發(fā)酵周期30 d；枯草芽孢桿菌巨菌草溶液放入33 ℃培養(yǎng)箱中搖床發(fā)酵，發(fā)酵周期30 d。取出培養(yǎng)好的巨菌草滅菌，烘干。

1.3.2指標(biāo)測定 纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量測定采用中性洗滌纖維法測定[11]；總腐植酸和黃腐酸的測定采用容量法[12]。

1.3.3數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，n=3，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，分別對不同濃度化學(xué)試劑處理、不同發(fā)酵時(shí)間處理的巨菌草進(jìn)行單因素方差分析；并用Tukey’s-b法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)法制備巨菌草腐植酸的含量

硝酸提取有利于總腐植酸和黃腐酸的溶出(圖1)。與對照相比，12.5%、25.0%、37.5%、50.0%、62.5%的硝酸使巨菌草中總腐植酸和黃腐酸均顯著升高(P<0.05)，其中37.5%和62.5%硝酸能得到較高含量的黃腐酸，37.5%的總腐植酸含量最高，比對照提高了2.86倍。與對照相比，37.5%硝酸處理的巨菌草中纖維素含量無顯著變化(P>0.05)，半纖維素和木質(zhì)素的含量顯著下降(P<0.05)。

草酸提取有利于總腐植酸和黃腐酸的溶出(圖2)，2.5%、5.0%和10.0%濃度的草酸提取未使黃腐酸含量發(fā)生顯著變化(P>0.05)，而7.5%和12.5%提取均使黃腐酸含量顯著升高(P<0.05)。2.5%和12.5%的草酸更有利于總腐植酸的溶出。所有濃度的草酸均使纖維素和半纖維素的含量升高，而木質(zhì)素含量無顯著變化(P>0.05)。

鹽酸有利于總腐植酸和黃腐酸的溶出(圖3)，7.5%、15.0%、22.5%、30.0%、37.5%的鹽酸會使黃腐酸和腐植酸含量顯著升高(P<0.05)，同時(shí)，鹽酸處理會使纖維素、木質(zhì)素、半纖維素的含量下降。

乙酸處理對黃腐酸的溶出影響不大(圖4)，但10.0%、20.0%、40.0%、50.0%、60.0%、70.0%乙酸處理有利于總腐植酸的溶出，且50.0%乙酸處理具有最優(yōu)效果。

圖1 不同濃度硝酸處理對巨菌草各成分的影響Fig. 1 Effect of different nitric acid concentrations on components of Pennisetum sp.

同一指標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters of the same index indicate significant differences among different treatment groups at the 0.05 level； similarly for the following figures.

圖2 不同濃度草酸處理對巨菌草各成分的影響Fig. 2 Effect of different oxalic acid concentrations on components of Pennisetum sp.

圖3 不同濃度鹽酸處理對巨菌草各成分的影響Fig. 3 Effect of different hydrochloric acid concentrations on components of Pennisetum sp.

圖4 不同濃度乙酸處理對巨菌草各成分的影響Fig. 4 Effect of different acetic acid concentrations on components of Pennisetum sp.

5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%的氨水處理均有利于總腐植酸含量的提高(圖5)，尤其是10.0%氨水處理的巨菌草的總腐植酸含量得到了顯著提高(P<0.05)，5.0%、10.0%、15.0%的氨水處理后巨菌草的黃腐酸含量得到顯著提高(P<0.05)。10.0%、15.0%、20.0%氨水處理后，木質(zhì)素含量下降。

綜上所述，10.0%氨水提取巨菌草得到的腐植酸含量最高，其次為37.5%硝酸和37.5%鹽酸，草酸和乙酸提取得到的腐植酸最少。

2.2 生物法制備巨菌草腐植酸的含量

經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵的巨菌草纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量下降，黃腐酸含量和總腐植酸含量升高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，纖維素含量有所下降(圖6)。與對照相比，10和20 d發(fā)酵的巨菌草纖維素含量下降但不顯著(P>0.05)，30和60 d顯著下降(P<0.05)；半纖維素含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所下降，與對照相比，10、20、30 d發(fā)酵的巨菌草半纖維素含量下降不顯著(P>0.05)，而60 d表現(xiàn)為顯著下降(P<0.05)；木質(zhì)素含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所下降，與對照相比，10、20、30 d發(fā)酵的巨菌草木質(zhì)素含量下降不顯著(P>0.05)，而60 d表現(xiàn)為顯著下降(P<0.05)；總腐植酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長有所升高，與對照相比，10 d發(fā)酵的巨菌草總腐植酸含量升高不顯著(P>0.05)，20、30、60 d顯著升高(P<0.05)；黃腐酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所升高，和對照相比，10、20d發(fā)酵的巨菌草黃腐酸含量升高不顯著(P>0.05)，而30和60 d顯著升高(P<0.05)。

圖5 不同濃度氨水處理對巨菌草各成分的影響Fig. 5 Effect of different ammonia concentrations on components of Pennisetum sp.

圖6 枯草芽孢桿菌發(fā)酵對巨菌草各成分的影響Fig. 6 Effect of fermentation with Bacillus subtilis on components of Pennisetum sp.

隨著毛霉發(fā)酵時(shí)間的延長，纖維素含量和半纖維素含量均不顯著降低(P>0.05)(圖7)；木質(zhì)素含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所下降，與對照相比，10、20 d發(fā)酵的巨菌草木質(zhì)素含量下降不顯著(P>0.05)，而30和60 d顯著下降 (P<0.05)；總腐植酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長有所升高，與對照相比，10、20、30、60 d均顯著 升高(P<0.05)；黃腐酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所升高，與對照相比，10 d發(fā)酵的巨菌草黃腐酸含量升高不顯著(P>0.05)，而20、30和60 d顯著升高(P<0.05)。

經(jīng)過根霉發(fā)酵的巨菌草纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量下降，黃腐酸含量和總腐植酸含量升高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，纖維素含量有所下降，與對照相比，10、20和30 d發(fā)酵的巨菌草纖維素含量下降不顯著(P>0.05)，60 d下降顯著(P<0.05)(圖8)；半纖維素含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所下降，與對照相比，10、20、30 d發(fā)酵的巨菌草半纖維素含量下降不顯著(P>0.05)，而60 d顯著下降(P<0.05)；木質(zhì)素含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所下降，與對照相比，10 d發(fā)酵的巨菌草木質(zhì)素含量下降不顯著(P>0.05)，而20、30和60 d顯著下降(P<0.05)；總腐植酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長有所升高，與對照相比，10、20、30和60 d均顯著升高(P<0.05)；黃腐酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所升高，與對照相比，10 d發(fā)酵的巨菌草黃腐酸含量升高不顯著(P>0.05)，而20、30和60 d顯著升高(P<0.05)。

經(jīng)過青霉發(fā)酵的巨菌草纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量下降，黃腐酸含量和總腐植酸含量升高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，纖維素含量、半纖維素含量和木質(zhì)素含量均不顯著降低 (P>0.05)(圖9)；總腐植酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長有所升高，與對照相比，10 d發(fā)酵的巨菌草總腐植酸含量升高不顯著(P>0.05)，20、30、60 d顯著升高 (P<0.05)；黃腐酸含量隨發(fā)酵時(shí)間延長也有所升高，與對照相比，10 d發(fā)酵的巨菌草黃腐酸含量升高不顯著(P>0.05)，而20、30和60 d顯著升高 (P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

魯宇菡[13]利用黑木耳菌糠發(fā)酵制備生化黃腐酸，發(fā)現(xiàn)0～1 mol·L-1的NaOH有利于生化黃腐酸的溶出，生化黃腐酸的含量最高可達(dá)6%。呂品等[7]利用硝酸、乙酸、草酸、鹽酸、氨水提取稻草中的腐植酸，發(fā)現(xiàn)這5種試劑提取后腐植酸的含量均顯著升高(P<0.05)，其中硝酸>乙酸>鹽酸>氨水>草酸，本研究得到的結(jié)果不一致。

硝酸處理巨菌草后，纖維素含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，而半纖維素和木質(zhì)素含量顯著下降(P<0.05)，總腐植酸和黃腐酸均顯著升高(P<0.05)，根據(jù)瓦克斯曼學(xué)說[14-15]，木質(zhì)素是構(gòu)成腐殖質(zhì)的基本原料，因此，可以認(rèn)為硝酸處理有利于半纖維素和木質(zhì)素向總腐植酸和黃腐酸轉(zhuǎn)化。鹽酸處理的巨菌草和硝酸處理類似，也可以用瓦克斯曼的木質(zhì)素轉(zhuǎn)化學(xué)說來解釋。乙酸處理也有利于纖維素向總腐植酸轉(zhuǎn)化。10.0%、15.0%、20.0%的氨水處理也有利于木質(zhì)素向黃腐酸和總腐植酸轉(zhuǎn)化。草酸處理雖然有利于總腐植酸和黃腐酸的溶出，但是纖維素和半纖維素的含量同時(shí)升高，而木質(zhì)素含量無顯著變化(P>0.05)，因此不能用木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化學(xué)說來解釋，原因還需要進(jìn)一步探討。

圖8 根霉發(fā)酵對巨菌草各成分的影響Fig. 8 Effect of fermentation with Rhizopus on components of Pennisetum sp.

圖9 青霉發(fā)酵對巨菌草各成分的影響Fig. 9 Effect of fermentation with Penicillium on components of Pennisetum sp.

多種微生物具有降解纖維素和半纖維素的能力，劉志堅(jiān)等[16]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵蔗渣制備腐植酸，發(fā)現(xiàn)提高接種量和通氣量，延長發(fā)酵時(shí)間，控制37 ℃發(fā)酵，有利于提高腐植酸含量。木霉和青霉等多種真菌也已被證明可降解纖維素[17-18]。杭怡瓊等[19]等通過向培養(yǎng)基質(zhì)(稻草秸稈+20%棉籽殼)接種側(cè)耳真菌菌株發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中木質(zhì)素和纖維素含量在培養(yǎng)一段時(shí)間后明顯減少。Badis[20]認(rèn)為鏈霉菌菌株能在木質(zhì)素降解和腐殖質(zhì)更新方面具有一定的作用。侯勇[21]利用牛糞發(fā)酵秸稈，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，纖維素、木質(zhì)素及半纖維素含量下降，而腐殖質(zhì)的含量有所升高。Kakezawa等[22]發(fā)現(xiàn)真菌可加快稻草秸稈的腐殖化。

不同微生物在降解木質(zhì)素、 形成腐殖質(zhì)中所扮演的角色不同， 真菌在腐殖質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用，而細(xì)菌、放線菌起輔助作用[23]。本研究表明，經(jīng)過毛霉發(fā)酵的巨菌草纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量下降，黃腐酸含量和總腐植酸含量升高。

本研究中，枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉、青霉在巨菌草腐殖質(zhì)的形成中均起到了積極作用，這和來航線等[24]的研究一致。發(fā)酵法制備巨菌草的總腐植酸和黃腐酸均是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解所致[25]，真菌可能在細(xì)胞內(nèi)形成醌或其他芳香族化合物，在分泌到體外以及細(xì)胞自溶時(shí)很容易縮合-聚合成腐殖質(zhì)[26]。其中根霉對木質(zhì)素的降解程度最高，與對照相比，到發(fā)酵結(jié)束，木質(zhì)素降解了2.54倍，這和Dümig等[27]的研究結(jié)果一致，根霉發(fā)酵的巨菌草中總腐植酸和黃腐酸含量最高，和對照相比，總腐植酸含量提高了5.26倍，黃腐酸含量提高了0.71倍。青霉發(fā)酵的巨菌草中總腐植酸含量和黃腐酸含量最低，和空白相比，總腐植酸含量提高了1.09倍，黃腐酸含量提高了0.32倍。

與化學(xué)法相比，根霉發(fā)酵制備得到的總腐植酸含量是10.0%氨水提取得到的總腐植酸含量的1.45倍，毛霉發(fā)酵制備得到的總腐植酸含量是10.0%氨水提取得到的總腐植酸含量的1.29倍，而枯草芽孢桿菌和青霉發(fā)酵制備得到的總腐植酸含量比10.0%氨水提取得到的總腐植酸含量低。37.5%硝酸提取得到的黃腐酸含量是毛霉發(fā)酵制備得到的黃腐酸含量的1.79倍，22.5%鹽酸提取得到的黃腐酸含量是毛霉發(fā)酵制備得到的黃腐酸含量的1.98倍。

化學(xué)法和生物發(fā)酵法均能提高巨菌草中腐植酸和黃腐酸含量，且都和巨菌草中纖維素、半纖維素或木質(zhì)素的降解有關(guān)?？傮w來說，生物發(fā)酵法制備得到的總腐植酸含量比化學(xué)法提取得到的總腐植酸含量要高，而化學(xué)方法提取得到的黃腐酸含量比生物發(fā)酵法制備得到的黃腐酸含量要高。

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