采用響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜素的提取工藝

詹盛文，李磊，蒯振彧，李春玲，孟艷秋

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，沈陽 110142)

大蒜(AlliumsativumL.)又叫蒜頭、胡蒜等，是百合科蔥屬植物。我國對大蒜的使用不僅具有悠久的歷史，還積累了豐富的經(jīng)驗。體現(xiàn)在大蒜除了當(dāng)作調(diào)味品被食用外，還有很好的藥用價值?！睹t(yī)別錄》記載：“大蒜具有散癰腫魘瘡，除風(fēng)邪，殺毒氣的功效”。《本草拾遺》也記載：“大蒜可以去水惡瘴氣，除風(fēng)濕，破冷氣，爛疵癬，伏邪惡，宜通濕補，無認加?！泵鞒顣r珍著《本草綱目》中稱“大蒜搗汁飲，治吐血心病，煮汁飲

治角產(chǎn)反漲，搗膏敷臍能達下焦，消水利大小便，貼足心能引熱下行，治泄瀉暴痢及干濕霍亂；止衄血，納肛中能通幽門治關(guān)格不通等?！?/p>

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：大蒜中的大蒜素(allicin)具有很好而廣泛的藥理活性。在心腦血管方面，起到抗血脂、抗高血壓和抗動脈粥樣硬化的作用[1-3]；在抗微生物方面，具有抗病毒、抗菌、抗真菌和抗寄生蟲的功效[4-6]。在中國的一項調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，長期有規(guī)律地食用大蒜的人群比其他人患癌的風(fēng)險降低了1000倍左右，進一步研究發(fā)現(xiàn)是大蒜素抑制了致癌物的激活[7,8]。

研究發(fā)現(xiàn)：大蒜素的生成主要來自于其前提物質(zhì)蒜氨酸(alliin)。而蒜氨酸在大蒜體內(nèi)的生物合成途徑主要有以下兩條：其一是谷胱甘肽中的半胱氨酸被烯丙基化，然后經(jīng)過一系列步驟，生成蒜氨酸。在這個過程中同時也伴隨著谷胱甘肽的降解；另一條途徑是谷胱甘肽不直接參與反應(yīng)，而是直接半胱氨酸烯丙基化，隨后生成S-烯丙基半胱氨酸，最后經(jīng)過氧化生成蒜氨酸[9,10]，主要步驟見圖1。

圖1 蒜氨酸生物合成途徑Fig.1 The biosynthesis pathway of alliin

注：GSH為L-半胱氨酸；GSAC為γ-L-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸。

在大蒜組織細胞破碎的情況下，蒜酶(alliinase)與底物蒜氨酸接觸，觸發(fā)一系列酶解反應(yīng)。主要分為兩步：第一步是蒜氨酸在蒜酶的作用下，一分子的蒜氨酸得到一分子烯丙基磺酸；第二步是兩分子的烯丙基磺酸分子間脫水縮合為大蒜素[11]，具體步驟見圖2。

提取大蒜素的方法主要有三種，分別是水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法和有機溶劑提取法。水蒸氣蒸餾法要在高溫條件下進行，這使得蒜酶容易失活而不能充分地進行上述酶解過程，以致大蒜素生成減少。同時，大蒜素在高溫條件下很容易降解。而超臨界流體萃取法操作成本過高，無法大規(guī)模地應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。所以這兩種方法都存在其局限性，而不能成為大蒜素提取的最適方法。有機溶劑提取法條件溫和，最重要的是它的酶解過程和提取過程是獨立進行的。這樣不僅能夠充分多地獲得大蒜素，而且還能大量地提取出來。但是，工藝路線的延長，必然引入許多影響收率的因素。本實驗選取四個決定性因素進行考察，以期獲得最佳的大蒜素提取工藝條件，從而為工業(yè)化生產(chǎn)提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料和試劑

新鮮大蒜：沈陽大商佳商城；大蒜素標(biāo)準品(PCS0325)：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；乙醇(分析純)；甲醇(色譜純)。

1.1.2 主要儀器

RE-52cs旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠； SHZ-2000型雙配套循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司； JJ-2(2003-61)型組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；TDZ5-WS臺式低速平衡離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司； KDOQX-1000超聲儀 上?？齐姽?； 安捷倫-1200系列高效液相色譜儀(HPLC，4.6 mm×250 mm，0.5 μm) 美國安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

選取新鮮大蒜，去皮，用蒸餾水洗凈，淋干。選取適量置于組織搗碎勻漿儀中搗碎成泥。蒜泥移置燒杯中，加入適量去離子水，置于恒溫箱中酶解。酶解后按料液比1∶5(g/V)的比例加入95%乙醇。稀釋后的原料液置于超聲儀中超聲提取，離心(9000 r/min，20 min，26 ℃)，取上清液。上清液用濾紙過濾得大蒜素提取液。旋蒸濃縮到一定濃度，稀釋定容到100 mL容量瓶中。吸取20 μL過微孔濾膜，注射入高效液相色譜儀，測定。

1.2.2 標(biāo)準曲線的繪制

稱取10.46 mg大蒜素標(biāo)準品，用甲醇稀釋到50 mL容量瓶中作為貯備液。精密吸取1，2，3，4，5，8，10 mL貯備液定容到10 mL容量瓶中。每個濃度梯度的標(biāo)準液經(jīng)過高效液相色譜儀測量，每個濃度測量2次，取平均值。色譜條件設(shè)置為：流速1 mL/s，柱溫32 ℃，紫外檢測波長為214 nm，流動相為水∶甲醇為15∶85(V/V)[12]。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準液濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線圖(見圖3)，同時獲得一元線性回歸方程：A=9746.62C+10.13(R=0.9991)。

圖3 大蒜素標(biāo)準曲線圖Fig.3 Standard curve of allicin

1.2.3 單因素試驗

試驗前處理：將新鮮大蒜去皮洗凈之后，打漿成蒜泥。稱取10 g蒜泥，加入適量的去離子水，調(diào)節(jié)pH值為6.8。

根據(jù)要考察的4個因素，每次考察1個因素時要固定另外3個因素。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，首先，確定酶解時間為30 min，超聲功率為45 W，超聲溫度為35 ℃來考察酶解溫度對大蒜素收率的影響；其次，確定酶解溫度為40 ℃，超聲功率為45 W，超聲溫度為35 ℃來考察酶解時間對大蒜素收率的影響；再次，確定酶解溫度為40 ℃，酶解時間為30 min，超聲溫度為35 ℃來考察超聲功率對大蒜素收率的影響；最后，確定酶解溫度為40 ℃，酶解時間為30 min，超聲功率為45 W來考察超聲溫度對大蒜素收率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Benhnken軟件試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，以酶解溫度(A)、酶解時間(B)、超聲功率(C)和超聲溫度(D)4個因素，分別取低、中和高3個水平，用-1，0，1表示進行編碼(見表1)。最后以大蒜素收率為響應(yīng)值。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計水平表Table 1 Factors and levels of response surface test design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 酶解溫度對大蒜素收率的影響

圖4 酶解溫度對大蒜素收率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield of allicin

由圖4可知，大蒜素收率隨著酶解溫度的升高而出現(xiàn)增減。大蒜素收率隨著溫度的逐漸升高首先以較緩的速度增加，隨后增速加快，持續(xù)到大約36 ℃左右時，大蒜素收率達到最佳酶解溫度的臨界值。這樣的變化可以解釋為：蒜氨酸酶的活性隨著溫度的增加，活性不斷增強，當(dāng)達到最適溫度時，酶的活性也最高，因此蒜氨酸也能最充分地被酶解為大蒜素。而在拐點之后，大蒜素收率隨著溫度的增加出現(xiàn)下降的趨勢，這是因為過高的溫度導(dǎo)致酶的活性下降，如果繼續(xù)升高溫度，酶出現(xiàn)失活，大蒜素就無法獲得了[13]。

2.1.2 酶解時間對大蒜素收率的影響

圖5 酶解時間對大蒜素收率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the yield of allicin

由圖5可知，大蒜素收率隨著酶解時間的變化情況。大蒜素收率隨著時間的延長出現(xiàn)平穩(wěn)的增加，大約在提取時間為30 min時出現(xiàn)一個高值。隨后大蒜素收率漸趨平緩，不再隨著時間的延長而出現(xiàn)波動。這一結(jié)果可以解釋為：開始時蒜氨酸分子的酶解活動平穩(wěn)進行，當(dāng)經(jīng)過一段時間后，蒜氨酸已經(jīng)全部轉(zhuǎn)化為大蒜素，所以接下來不會再有大蒜素生成。反而，由于大蒜素的揮發(fā)性，長時間的放置會出現(xiàn)不增反減的現(xiàn)象。

2.1.3 超聲功率對大蒜素收率的影響

圖6 超聲功率對大蒜素收率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield of allicin

由圖6可知超聲功率對大蒜素收率的影響情況。在超聲功率加大的過程中，大蒜素收率也在不斷提高。當(dāng)功率大概到45 W時，出現(xiàn)了最大值。而之后再不斷地增大功率時，大蒜素收率出現(xiàn)下降的趨勢。這可以解釋為低強度的超聲波能夠起到空化效應(yīng)，即類似于機械攪拌的作用。能夠促進目標(biāo)物質(zhì)迅速地轉(zhuǎn)移到溶劑中來。而過高的功率可能是引起了大蒜素這種不穩(wěn)定物質(zhì)的降解。

2.1.4 超聲溫度對大蒜素收率的影響

圖7 超聲溫度對大蒜素收率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the yield of allicin

由圖7可知超聲溫度對大蒜素收率的影響情況。隨著超聲溫度的提高，大蒜素收率出現(xiàn)較小幅度的增加，大約在36 ℃附近出現(xiàn)最佳臨界溫度。之后再升高溫度大蒜素收率出現(xiàn)下降的趨勢，當(dāng)達到某一溫度時這種趨勢變得越大越明顯。這可能是適宜的溫度能讓目標(biāo)分子更加活躍，以致大量轉(zhuǎn)移到溶劑中去。而過高的溫度顯然不適于大蒜素分子的穩(wěn)定，而發(fā)生降解為小分子的情況。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對酶解溫度、酶解時間、超聲功率和超聲溫度進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。借助Design-Expert 8.0.6軟件進行分析，獲得大蒜素最佳提取工藝條件，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析和結(jié)果Table 2 Response surface analysis and results

方差分析結(jié)果顯示：模型(P=0.0026)顯著，失擬項(P=0.1406)不顯著。一次項中酶解溫度(P=0.0018)、超聲功率(P=0.0107)和超聲溫度(P=0.0031)為顯著水平。二次項中酶解溫度(P=0.0004)和超聲溫度(P=0.0009)為極顯著水平，酶解時間(P=0.001)和超聲功率(P=0.001)為顯著水平。交互項中酶解溫度與酶解時間(P=0.0099)以及酶解溫度與超聲溫度(P=0.0068)為顯著水平。其他項均為不顯著水平。進一步分析發(fā)現(xiàn)，各因素對大蒜素收率的影響的顯著性順序是：酶解溫度>超聲溫度>超聲功率>酶解時間。

以大蒜素收率作為響應(yīng)值Y(mg/g)，酶解溫度(A)、酶解時間(B)、超聲功率(C)和超聲溫度(D)為因素。經(jīng)過二次回歸擬合得到一個四元二次回歸方程：

Y=3.00-0.019A-0.027B+0.026C-0.11D+0.023AB+0.00875AC-0.00825AD-0.058BC+0.12BD-0.05CD-0.19A2-0.17B2-0.17C2-0.17D2。

根據(jù)回歸方程得到大蒜素提取最佳工藝條件為酶解溫度35.49 ℃、酶解時間31.09 min、超聲功率49.49 W和超聲溫度28.60 ℃。在此條件下大蒜素收率預(yù)測值能夠達到3.024 mg/g。我們從實際出發(fā)，把各因素數(shù)值校正為酶解溫度35 ℃、酶解時間31 min、超聲功率49 W和超聲溫度29 ℃后。用此條件進行3次重復(fù)的驗證試驗，獲得大蒜素收率均值為3.018 mg/g，說明預(yù)測值與實際值具有較好的擬合性，同時也證明了回歸模型的可靠性。

2.2.2 交互作用的響應(yīng)面圖分析

為了直觀明顯地展現(xiàn)4個因素對大蒜素收率的交互作用，使用Design-Expert 8.0.6軟件對其中的每2個因素做出響應(yīng)曲面圖，見圖8。

圖8 兩因素交互作用對大蒜素收率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.8 The response surface map of the effect of two factors on the yield of allicin

注：A為酶解溫度與酶解時間的交互作用；B為酶解溫度與超聲功率的交互作用；C為酶解溫度與超聲溫度的交互作用；D為酶解時間與超聲功率的交互作用；E為酶解時間與超聲溫度的交互作用；F為超聲功率與超聲溫度的交互作用。

圖8中A，C顯示曲面比較陡峭，說明酶解溫度和酶解時間以及酶解溫度和超聲溫度的交互作用明顯。相反，B，D，E，F(xiàn)的曲面表現(xiàn)較平緩，其他各項之間的交互作用不明顯。

3 討論

大蒜是一種極普遍的食藥兩用的植物，所含的大蒜素是評價其藥用價值的重要指標(biāo)。通過對其前體物質(zhì)蒜氨酸的生物合成途徑的研究，以及掌握酶解反應(yīng)條件下大蒜素的生成方式，可以從分子水平揭示提取大蒜素所要注意的關(guān)鍵性條件。本實驗通過對大蒜素提取的4個因素進行考察，借助Box-Benhnken軟件設(shè)計方法，最后確定了酶解溫度、超聲功率和超聲溫度對大蒜素提取具有顯著作用。通過擬合方程計算確定出大蒜素提取的最佳工藝參數(shù):酶解溫度35 ℃、酶解時間31 min、超聲功率49 W和超聲溫度29 ℃。在此參數(shù)條件下大蒜素收率預(yù)測值達到3.024 mg/g，驗證值為3.018 mg/g，很好地說明了模型的高擬合度。

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