桑葚酵素生物活性的檢測(cè)與研究

王瑾，劉新利

(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

桑葚(Mulberry)，又作桑椹，為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥果穗。桑葚為聚花果，顏色主要有黃棕色、棕紅色至暗紫色，還有的成熟后呈乳白色。我國(guó)有15個(gè)桑種和3個(gè)變種，是世界上桑樹品種最多的國(guó)家之一。桑葚酸甜可口，味道鮮美，是人們經(jīng)常食用的水果之一。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為桑葚既能入食，也能入藥，味甘酸，性微寒。除作為滋補(bǔ)品外，桑葚還具有調(diào)節(jié)人體免疫力、降低人體內(nèi)血糖和血脂、抗氧化、抗衰老、保護(hù)肝臟、促進(jìn)造血細(xì)胞生長(zhǎng)等作用。主治陰血不足而致的頭暈?zāi)垦?、耳鳴心悸、煩躁失眠、須發(fā)早白等癥[1]。常食桑葚能夠補(bǔ)益肝腎，滋陰養(yǎng)血，清肝明目，提高人體免疫力，延緩衰老。

酵素是以動(dòng)物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[2]。在之前的文獻(xiàn)報(bào)道中可以看到，很多人把酵素誤以為是“酶”。然而經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，酵素不等于我們傳統(tǒng)意義上所

說的 “酶”。酵素的營(yíng)養(yǎng)主要來自于三個(gè)方面：首先，酵素中含有黃酮類物質(zhì)、植物色素和各種酶類等活性成分，可消除不利于健康的活性氧，幫助人體抗氧化、防衰老。其次，酵素屬于發(fā)酵產(chǎn)品，其含有的活性益生菌進(jìn)入腸道后，可以迅速進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，起到預(yù)防感染、維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用。第三，酵素原料來源豐富，原料中含有的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等各種營(yíng)養(yǎng)成分也有益于人體的健康[3]。因此，酵素是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的發(fā)酵產(chǎn)品，其內(nèi)部含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及抗氧化成分均對(duì)人體有益，多飲酵素能夠改善人體腸道環(huán)境，延緩衰老，提高人體免疫機(jī)能。

目前，酵素研發(fā)已經(jīng)成為一股新的“市場(chǎng)熱”，各種酵素產(chǎn)品相應(yīng)上市，國(guó)家也正在出臺(tái)一系列相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)以確保酵素市場(chǎng)的安全與穩(wěn)定。關(guān)于桑葚酵素，目前研究較多的就是關(guān)于桑葚酵素的研制工藝，如何改善其口感，而關(guān)于其生物活性方面的研究鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

桑葚酵素：市場(chǎng)上某公司購(gòu)買的桑葚酵素。

1.1.2 試劑

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑、碳酸鈉、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸鐵銨、甲醇、異丙醇、甲酸、正丁醇、濃鹽酸、過硫酸鉀、無水乙醇等，分析純；DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)，Sigma公司；ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))，阿拉丁公司。

1.1.3 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(UV 6100型)；高效液相色譜儀(島津LC-20AT型)。

1.2 桑葚酵素的制備

選取新鮮桑葚→打漿→添加C、N源→滅菌→接入酵母菌、乳酸菌等益生菌→發(fā)酵→檢測(cè)pH值→過濾→后熟→成分檢測(cè)→加糖調(diào)節(jié)口感。

1.3 酵素中抗氧化物質(zhì)的檢測(cè)

1.3.1 多酚含量的測(cè)定

本研究采用Folin-Ciocalteau法測(cè)定酵素中的總酚含量，配制1000 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再稀釋成濃度分別為10，20，30，40，50 μg/mL的沒食子酸工作液。量取沒食子酸工作液和蒸餾水各1 mL于試管中，再分別加入5.0 mL的10%福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8 min內(nèi)，加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻，室溫下放置60 min，用10 mm比色皿在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值[4]。根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將酵素溶液進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋，量取1 mL進(jìn)行測(cè)定。樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.2 原花青素含量的測(cè)定

參照GB/T 22244-2008，采用高效液相色譜法測(cè)定酵素中原花青素的含量，檢測(cè)原理是樣品中原花青素單體或聚合物在加熱的酸性條件和鐵鹽催化作用下，C-C鍵斷裂，然后生成深紅色的花青素離子即氰定[5]，再使用高效液相色譜進(jìn)行分析，從而確定試樣中原花青素含量。

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g溶于10 mL甲醇中，吸取該溶液0.1，0.25，0.5，1.0，1.5 mL置于10 mL棕色容量瓶中(最終濃度分別為0.5，1.25，2.5，5，7.5 mg/mL)，加甲醇至刻度，搖勻。各取2 mL測(cè)定。把正丁醇和濃鹽酸按照95∶5的體積比進(jìn)行混合，量取15 mL置于具塞錐形瓶中，再加入0.5 mL硫酸鐵銨溶液(2%)和2 mL試樣溶液，混合均勻，將錐形瓶放置于沸水浴中精確加熱40 min，再立即放入冰水中進(jìn)行冷卻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待進(jìn)行高效液相色譜分析。取2 mL樣品進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜條件見表1。

表1 高效液相色譜條件

1.4 酵素抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.4.1 對(duì)DPPH·自由基清除作用的測(cè)定

DPPH·自由基清除能力的測(cè)定根據(jù)Wang X Z等描述的方法，先用蒸餾水將酵素樣品稀釋成不同濃度的測(cè)試液，然后配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH·溶液，即準(zhǔn)確稱取10 mg DPPH·用無水乙醇溶解到250 mL容量瓶中。取2 mL DPPH·溶液與1 mL待測(cè)液混合均勻，室溫下放置30 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，用95%的乙醇溶液做空白對(duì)照[6]。

抑制率(%)=(1—AS/A0)×100。

式中：AS為2 mL DPPH·溶液與1 mL樣品的吸光度；A0為2 mL DPPH·溶液與1 mL 95%乙醇的吸光度。

1.4.2 對(duì)ABTS·自由基清除作用的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取ABTS·3 mg，加蒸餾水0.735 mL，配制成7.4 mmol/L的ABTS·儲(chǔ)備液；再準(zhǔn)確稱取K2S2O81 mg，加蒸餾水1.43 mL，配制成2.6 mmol/L K2S2O8儲(chǔ)備液。分別量取0.5 mL的ABTS·儲(chǔ)備液和K2S2O8儲(chǔ)備液，混合均勻，黑暗條件下室溫放置12 h。然后用95%乙醇進(jìn)行稀釋，稀釋到A734 nm=0.7±0.02。取2 mL的稀釋液與0.5 mL不同濃度梯度的酵素溶液混合，室溫下放置6 min后，在734 nm下測(cè)吸光值。用95%的乙醇溶液作為空白對(duì)照[7]。抑制率的計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=(1-AS/A0)×100。

式中：AS為2 mL ABTS·溶液與0.5 mL酵素稀釋液的吸光度；A0為2 mL ABTS·溶液與0.5 mL 95%乙醇的吸光度。

1.4.3 桑葚酵素中SOD活性測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定桑葚酵素中SOD的活性[8]，按照表2，在對(duì)照管與樣品管中加入相應(yīng)體積的緩沖液和雙蒸水，放置到25 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min后，再加入預(yù)熱過的25 ℃鄰苯三酚(對(duì)照管中用10 mmol/L鹽酸溶液進(jìn)行代替)，迅速搖勻后立即倒入10 mm比色皿中，在波長(zhǎng)325 nm處每隔30 s測(cè)定1次吸光值A(chǔ)0。測(cè)定樣品中SOD活性時(shí)，在樣品管中加入0.5 mL稀釋后的樣品溶液和3.7 mL雙蒸水，其他步驟一致，得到ASOD。

表2 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定加樣表

抑制率(%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100%，酶活力(U/mL)=(抑制率/50%)×(V1/V2)×n。

式中：V1為反應(yīng)液的總體積，mL；V2為測(cè)定樣品的體積，mL；△A0為鄰苯三酚自氧化速率；△ASOD為樣品光密度值變化速率；n為酵素稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑葚酵素抗氧化物質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 多酚含量測(cè)定結(jié)果

多酚類化合物，具有抗氧化、延緩衰老、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性[9]，是一種優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)，在醫(yī)藥和食品業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，線性回歸方程為：y=86.987x-1.3674(R2=0.9995)。

式中：y為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)，x為吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明沒食子酸在濃度為10～50 mg/L區(qū)間有良好的線性關(guān)系。桑葚酵素稀釋50倍后吸光值為0.387，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得到其多酚含量為32.30 mg/L，則酵素中多酚物質(zhì)含量為1.615×103mg/L。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 原花青素含量測(cè)定結(jié)果

原花青素，簡(jiǎn)稱OPC，一種在多種植物中都有存在的多酚類化合物，名稱來源是其在加熱的狀態(tài)下能產(chǎn)生紅色的花青素，它在醫(yī)藥、化妝品及食品行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)研究表明：原花青素的抗自由基氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍，并且能夠被人體迅速吸收，口服20 min即可達(dá)到最高血液濃度，代謝半衰期長(zhǎng)達(dá)7 h[10]，是一種優(yōu)良的天然抗氧化物質(zhì)。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，線性回歸方程為：y=3×10-6x-0.3728(R2=0.9992)。

式中：y為原花青素濃度(g/L)，x為吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明原花青素在濃度為0.5～7.5 mg/mL區(qū)間有良好的線性關(guān)系。

表3 原花青素標(biāo)樣峰面積和濃度對(duì)比

圖2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

桑葚酵素液相的峰面積為1905871，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得原花青素濃度為5.344 mg/mL。

2.2 桑葚酵素抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 桑葚酵素對(duì)DPPH·自由基的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的自由基，其中心物質(zhì)是氮，若某物質(zhì)能夠?qū)⑵淝宄?，則表明該物質(zhì)具有降低羥自由基、烷自由基或氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。DPPH·溶于乙醇溶液后呈現(xiàn)深紫色，它有一個(gè)孤電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收峰。當(dāng)有自由基清除劑時(shí)，會(huì)與之反應(yīng)變成無色或淺黃色，在517 nm處吸光值也隨之降低[11]，可以用此來計(jì)算清除率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 桑葚酵素清除DPPH·自由基能力

由曲線可知，桑葚酵素具有較高的DPPH·自由基清除能力，用SPSS求得IC50值為稀釋18.796倍，即濃度為0.0532，遠(yuǎn)高于其他水果酵素。這可能是由于桑葚中含有抗氧化能力較高的原花青素以及多酚物質(zhì)，具有良好的DPPH·自由基清除能力。

2.2.2 桑葚酵素對(duì)ABTS·自由基的清除作用

ABTS·在氧化劑作用下能夠氧化成綠色的ABTS·，當(dāng)有抗氧化物存在時(shí)，ABTS·的產(chǎn)生會(huì)得到抑制，在734 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，測(cè)定該波長(zhǎng)下ABTS·相應(yīng)的吸光度即可計(jì)算出樣品的總抗氧化能力[12]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 桑葚酵素清除ABTS·自由基能力

由圖4可知，桑葚酵素具有較高的ABTS·自由基清除能力，用SPSS求得IC50值為稀釋7.456倍，即濃度為0.134。

2.2.3 桑葚酵素內(nèi)SOD測(cè)定結(jié)果

將桑葚酵素稀釋10倍后進(jìn)行SOD活性檢測(cè)，經(jīng)計(jì)算，當(dāng)桑葚酵素濃度為10%時(shí)，抑制率達(dá)76.23%，再根據(jù)稀釋倍數(shù)算出桑葚酵素的SOD活力為240 U/mL。這表明桑葚酵素具有較強(qiáng)的自由基清除能力，具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂、抗輻射和美容的功能。

3 結(jié)論

本文從桑葚酵素的抗氧化成分以及對(duì)不同自由基的清除能力方面對(duì)其進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果表明：桑葚酵素中的多酚物質(zhì)和原花青素含量較高，對(duì)DPPH·自由基有較強(qiáng)的清除作用，對(duì)ABTS·自由基也有一定的清除作用，這與它較高的多酚濃度和原花青素濃度有一定的關(guān)系。這表明桑葚酵素能夠清除人體內(nèi)的自由基，減少自由基對(duì)人體造成的傷害，具有增強(qiáng)人體免疫力、抗氧化和抗衰老的功能。此外，桑葚酵素中也具有較高的SOD酶活性，具有很好的美容養(yǎng)顏的功效，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)良保健飲品。

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