不同劑量輻射對(duì)NOD/SCID小鼠腸損傷的影響

杜 彬，原 杰，任召祺，安 媛，江 峰，李 軍，楊 超

1火箭軍總醫(yī)院輸血科，北京 100088 2北京市紅十字血液中心，北京 100088

放射性腸損傷主要見(jiàn)于核事故及戰(zhàn)爭(zhēng)中的核爆炸，也是臨床腹部腫瘤放療引起的重要并發(fā)癥之一[1]。體內(nèi)代謝活躍的腸道組織對(duì)電離輻射十分敏感，在輻射過(guò)程中，位于小腸隱窩的干細(xì)胞和腸絨毛結(jié)構(gòu)會(huì)遭到一定程度的破壞，導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞、腸上皮屏障功能受損、腸道細(xì)菌發(fā)生易位，嚴(yán)重威脅到患者的生命和生存質(zhì)量[2- 3]。放射性腸損傷的發(fā)病機(jī)制主要認(rèn)為是血管性損傷、腸上皮屏障的破壞和內(nèi)源性損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，其主要病理改變?yōu)殡[窩結(jié)構(gòu)的破壞，絨毛脫落、黏膜萎縮，腸管發(fā)生黏連，甚至形成腸瘺，腸黏膜結(jié)構(gòu)屏障受到破壞，發(fā)生細(xì)菌易位，導(dǎo)致細(xì)菌與內(nèi)毒素入血，產(chǎn)生菌血癥、敗血癥和多器官功能衰竭等并發(fā)癥，嚴(yán)重危及患者的生命[4- 6]。雖然研究人員對(duì)放射性腸損傷的防治已進(jìn)行了廣泛的研究，但目前對(duì)于放射性腸損傷尚無(wú)有效的治療措施[7- 8]。因此，建立適合臨床研究的放射性腸損傷動(dòng)物模型具有重要的意義。本研究根據(jù)臨床放射性腸損傷的發(fā)病率、死亡率及病理組織學(xué)特征，綜合文獻(xiàn)對(duì)放射性腸損傷模型應(yīng)達(dá)到的要求，比較了3種不同劑量輻射對(duì)NOD/SCID小鼠腸損傷的影響，以期尋找適合建立NOD/SCID小鼠放射性腸損傷模型的輻射劑量，為放射性腸損傷的防治研究提供幫助。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性健康SPF級(jí)NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠 40只，6～8周齡，體質(zhì)量18.0～24.0 g，購(gòu)自北京維通利華公司[合格證號(hào)為SCXK(京)2012- 0001]。實(shí)驗(yàn)前3 d飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境，溫度控制在20～22℃，并實(shí)行12 h光照和12 h黑暗交替。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組4組，每組10只。照射組小鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于特制的盒子中，全腹部接受60Co γ射線照射，上至胸骨劍突，下至恥骨聯(lián)合，身體其余部位用5 cm厚鉛磚屏蔽。照射劑量分別為4、5、6 Gy，劑量率為1 Gy/min。照射后小鼠可自由活動(dòng)及飲水，并喂以標(biāo)準(zhǔn)鼠食。于照射前和照射后每天記錄小鼠的生存情況和體質(zhì)量變化，存活小鼠于照射后第15天處死取標(biāo)本，分別觀察腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌易位率和腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

觀測(cè)指標(biāo)

一般情況：觀察小鼠的飲食、精神狀態(tài)、存活情況、有無(wú)腹瀉、血便及體質(zhì)量變化。

細(xì)菌移位情況：小鼠用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在無(wú)菌狀態(tài)下取腸系膜淋巴結(jié)加1 ml無(wú)菌生理鹽水勻漿后，加入5 ml TSB培養(yǎng)基中，37℃孵育24 h，觀察腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位情況，培養(yǎng)基渾濁即為陽(yáng)性。

腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化：取小鼠小腸組織，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜及絨毛組織的形態(tài)學(xué)變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用一元方差分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

小鼠的存活情況空白對(duì)照組小鼠均存活。照射后15 d，4、5、6 Gy照射組小鼠的生存率分別為60%、50%、30%(圖1)。

小鼠生理狀況照射后第5天即可見(jiàn)5 Gy照射組和6 Gy照射組小鼠進(jìn)食減少、毛發(fā)凌亂、活動(dòng)減少，出現(xiàn)弓背、脫毛現(xiàn)象。4 Gy照射組小鼠糞便潛血實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率80%(圖2)，5 Gy照射組和6 Gy照射組小鼠腹瀉導(dǎo)致肛周紅腫、脫肛，肉眼可見(jiàn)血便，陽(yáng)性率100%(圖3)。

小鼠體質(zhì)量的變化照射前，空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組小鼠的體質(zhì)量分別為(22.60±2.23)、(22.94±1.02)、(22.54±1.27)、(23.06±1.31)g，各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；照射后15 d，空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組小鼠的體質(zhì)量分別為(24.06±1.88)、(21.26±2.07)、(19.92±1.42)、(18.26±3.02)g，5 Gy照射組(P=0.015)和6 Gy照射組(P=0.011)小鼠的體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組，4 Gy照射組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位率細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組小鼠的細(xì)菌移位率分別為0、20%、50%、70%。

小鼠腸道組織的病理學(xué)變化解剖觀察小鼠的小腸組織標(biāo)本。

肉眼觀察：空白對(duì)照組小鼠的腸管光滑，色澤正常；照射組各組小鼠的腸管腫脹或出血、顏色變暗，甚至出現(xiàn)黏連(圖4)。

圖1小鼠生存率

Fig1Survival rate of mice

A.空白對(duì)照組；B.4 Gy照射組；C.5 Gy照射組；D.6 Gy照射組

A.blank control group；B.4-Gy group；C.5-Gy group；D.6-Gy group

圖2糞便潛血實(shí)驗(yàn)

Fig2Fecal occult blood test

A.空白對(duì)照組；B.4 Gy照射組；C.5 Gy照射組；D.6 Gy照射組

A.blank control group；B.4-Gy group；C.5-Gy group；D.6-Gy group

圖3小鼠肉眼血便情況

Fig3Visible blood in the stool of mice

鏡下觀察：與空白對(duì)照組相比，照射組小鼠腸組織的腸黏膜絨毛和腺體均受到破壞，4 Gy照射組小腸絨毛長(zhǎng)度變低；5 Gy照射組腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)寬大低平，并倒?fàn)?，伴有上皮?xì)胞脫落，腺體發(fā)生萎縮，隱窩結(jié)構(gòu)破壞；6 Gy照射組腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)受損，絨毛離斷破碎，隱窩結(jié)構(gòu)缺失，組織間有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)點(diǎn)狀出血或壞死(圖5)。

各組小腸絨毛長(zhǎng)度的比較：照射后3 d，空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組小鼠的小腸絨毛長(zhǎng)度分別為(371.49±31.23)、(308.65±10.87)、(295.44±23.67)、(262.98±28.15)μm，其中，4 Gy照射組(P=0.023)、5 Gy照射組(P=0.009)、6 Gy照射組(P=0.001)均明顯低于空白對(duì)照組；照射后7 d，空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組小鼠的小腸絨毛長(zhǎng)度分別為(380.06±52.28)、(284.03±31.19)、(261.87±21.02)、(230.40±22.10)μm，其中，4 Gy照射組(P=0.009)、5 Gy照射組(P=0.003)、6 Gy照射組(P=0.001)均明顯低于空白對(duì)照組；照射后15 d，空白對(duì)照組、4 Gy照射組、5 Gy照射組、6 Gy照射組小鼠的小腸絨毛長(zhǎng)度分別為(361.77±22.77)、(291.68±32.45)、(248.03±51.09)、(195.90±26.39)μm，其中，4 Gy照射組(P=0.005)、5 Gy照射組(P<0.001)、6 Gy照射組(P<0.001)均明顯低于空白對(duì)照組，5 Gy照射組(P=0.041)和6 Gy照射組(P=0.001)明顯低于4 Gy照射組，6 Gy照射組明顯低于5 Gy照射組(P=0.020)。

A.空白對(duì)照組；B.4 Gy照射組；C.5 Gy照射組；D.6 Gy照射組

A.blank control group；B.4-Gy group；C.5-Gy group；D.6-Gy group

圖4小鼠腸組織大體標(biāo)本的觀察

Fig4Morphological observation of intestinal tissues

A.空白對(duì)照組；B.4 Gy照射組；C.5 Gy照射組；D.6 Gy照射組

A.blank control group；B.4-Gy group；C.5-Gy group；D.6-Gy group

圖5小鼠腸組織的病理學(xué)觀察結(jié)果(HE，×100)

Fig5Pathological observation of intestinal tissues(HE，×100)

討 論

隨著科技的迅猛發(fā)展，核能技術(shù)在軍事、醫(yī)療、科研及工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。戰(zhàn)爭(zhēng)中的核爆炸、核事故及腫瘤放療等均會(huì)造成不可避免的放射性損傷[9]。全球每年約有50萬(wàn)患者接受腹盆腔的放療，其中5%～10%患者在未來(lái)10年內(nèi)可進(jìn)展成放射性腸損傷[10]。正常狀態(tài)下，小腸黏膜的上皮細(xì)胞代謝活躍，更新速度快，隱窩上皮細(xì)胞不斷增殖分化，向絨毛上皮移行，同時(shí)，絨毛上皮生理性脫落，通過(guò)動(dòng)態(tài)平衡來(lái)維持腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性和正常的生理功能。當(dāng)機(jī)體受到一定劑量的輻射后，隱窩上皮細(xì)胞的增殖受到抑制，導(dǎo)致絨毛上皮缺乏更新，會(huì)破壞小腸絨毛的完整性，腸道細(xì)菌發(fā)生易位，黏膜潰瘍、壞死及出血，最終導(dǎo)致內(nèi)源性敗血癥或多臟器功能衰竭等致死性并發(fā)癥[11- 12]。目前，臨床有大量放射性腸損傷的病例，雖然其病理表現(xiàn)明確，但發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全清楚[13- 14]。放射性腸損傷尚缺乏特效的治療手段[15]。因此，基于充分了解放射性腸損傷的穩(wěn)定可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)其防治研究顯得尤為重要。

文獻(xiàn)報(bào)道的放射性腸損傷動(dòng)物模型的輻射劑量和所用動(dòng)物不完全一致[16- 17]。Brook等[18]應(yīng)用4.25 Gy和10 Gy的60Co輻射的小鼠放射性腸炎模型實(shí)現(xiàn)降低腸道細(xì)菌易位率及死亡率。盡管不同研究所使用的輻射劑量及所用動(dòng)物不完全一致，但公認(rèn)應(yīng)該產(chǎn)生腸黏膜的組織學(xué)損傷，伴隨腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)菌易位，死亡率與臨床相似或略高[19]。NOD/SCID小鼠是在重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的基礎(chǔ)上與非肥胖性糖尿病(NOD/Lt)小鼠品系回交的免疫缺陷鼠，既有先天免疫缺陷，又有T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞缺陷，較少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，更適合臨床疾病的研究[20- 21]。因此，本研究選用NOD/SCID小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，比較了4、5、6 Gy的60Co γ射線對(duì)NOD/SCID小鼠全腹照射后所形成動(dòng)物模型的存活率、體質(zhì)量變化、腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)菌移位率及小腸標(biāo)本的病理學(xué)變化等。結(jié)果顯示，5 Gy60Co γ射線對(duì)全腹照射后小鼠的存活率為60%，體質(zhì)量顯著下降，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌易位率為60%，腸黏膜絨毛出現(xiàn)脫落甚至壞死，與臨床放射性腸損傷患者的發(fā)病率、癥狀及組織病理學(xué)改變相近，提示該照射劑量適當(dāng)、照射范圍合理，能較準(zhǔn)確地反映臨床急性放射性腸損傷的病理狀態(tài)。因此，應(yīng)用5 Gy的60Co γ射線全腹照射所形成放射性腸組織損傷的NOD/SCID小鼠模型，適合臨床放射性腸損傷防治研究的需要。

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