蘇合香丸中11-羰基-β-乙酰乳香酸的鑒別及含量測定

張明玥 潘葦芩 葛 婧 陳冬云 王偉萍

新疆自治區(qū)食品藥品檢驗所，新疆 烏魯木齊 830004

蘇合香丸是芳香開竅的代表方之一，由蘇合香、安息香、乳香(制)等15味藥材組成，適用于痰厥昏迷、中風偏癱、肢體不利等癥[1-2]。處方中的臣藥乳香在市場上價格較高，代用品、混淆品較多。2015年版《中國藥典》一部[3]乳香項下采用揮發(fā)油測定法控制其含量；蘇合香丸項下僅對冰片和丁香的含量進行了測定，均未建立乳香有效成分的含量測定。文獻報道[4-7]乳香中總?cè)祁愑袡C酸是其抗炎、鎮(zhèn)痛、抗免疫的主要有效成分，而11-羥基-β-乙酰乳香酸為三萜酸類化合物的主要活性成分之一。為進一步有關(guān)控制蘇合香丸的質(zhì)量，筆者采取薄層色譜法和高效液相色譜法對蘇合香丸中11-羥基-β-乙酰乳香酸進行鑒別和含量測定，以期為蘇合香丸的質(zhì)量控制和評價提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters公司高效液相色譜儀(Waters e2695型泵，Waters2998紫外檢測器)；Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Milli-Q A10型超純水儀(密理博公司)；KUDOS SK7510LHG型超聲儀(上?？茖С晝x器有限公司)。1.2 材料 11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品(批號：111706- 200601；中國藥品生物制品檢定所)；乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為純化水，乙醇為分析純。蘇合香丸(大蜜丸)：廠家A編號分別為0023、0041、0144、0145、0173、0188、0189、0194、0195、0196、0197、0377、0448、0449、0461；廠家B編號分別為0166、0203、0204、0212、0217、0479；廠家C編號為0185。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 供試溶液的制備 取本品1丸，加硅藻土2 g，研細，加乙醇15 mL，超聲(250W，40kHz)處理20 min，過濾，濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 取11-羰基-β-乙酰-乳香酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 將不含乳香的藥味按處方比例和制備方法制成陰性對照，按供試品溶液的制備方法制成不含乳香酸的陰性對照溶液。

2.1.4 TLC鑒別 照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述供試品溶液2～5 μL和對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。

結(jié)果表明，供試品溶液與對照品溶液在薄層板Rf值相同的位置顯相應(yīng)的熒光猝滅斑點。從結(jié)果可以看出，3個生產(chǎn)廠家的9批蘇合香丸均檢出11-羥基-β-乙酰乳香酸，但是不同廠家的11-羥基-β-乙酰乳香酸的斑點顏色深淺不同，表明各廠家蘇合香丸中11-羥基-β-乙酰乳香酸的含量不同。如圖1所示。為進一步驗證薄層色譜的檢驗結(jié)果，將3個廠家22批樣品進行乳香主成分11-羥基-β-乙酰乳香酸高效液相色譜含量測定。

2.2 高效液相色譜法含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫(見表 1)；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長241 nm，進樣量10 μL。

2.2.2 對照品、供試品溶液和陰性對照液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，搖勻，即得對照品儲備液。

表1 梯度洗脫條件

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品10丸，大蜜丸剪碎，取4 g，精密稱定，精密加入硅藻土2 g，研細，精密稱取適量(約相當于半丸的量)，精密加入乙醇15 mL，稱定重量，超聲處理(功率300W，頻率50Hz)30 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 將不含乳香的藥味按處方比例和制備方法制成陰性對照，按供試品溶液的制備方法制成不含乳香的陰性對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗及方法學考察2.2.3.1 檢測波長的選擇 取樣品(編號：0194)按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液；精密吸取對照品儲備液1.0 mL，置5 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度制備成濃度為0.2050 mg/mL的對照品溶液，在2.2.1項下色譜條件測定，進樣量10 μL，測定結(jié)果如圖2所示 。因此確定檢測波長為241 nm。

2.2.3.2 屬性與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液及不含乳香的陰性對照溶液分別進樣10 μL。蘇合香丸陰性樣品及空白溶劑色譜圖中，11-羰基-β-乙酰乳香酸的相應(yīng)保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，表明陰性對照液無11-羰基-β-乙酰乳香酸成分，此方法合理可行。在2.2.1項色譜條件下進樣分析，11-羰基-β-乙酰乳香酸與相鄰其他組分峰分離度為11.2，理論塔板數(shù)以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰計可達100000以上，11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的拖尾因子為0.99。如圖3所示。

2.2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品儲備液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置5 mL容量瓶中，分別加乙醇稀釋至刻度制備成濃度為0.0210、0.0510、0.1030、0.2050、0.3080、0.4100、0.5130 mg/mL的系列標準溶液。分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，11-羰基-β-乙酰乳香酸濃度(X，mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程Y=1.238 8×107X-580279，r=0.999 7，結(jié)果表明：11-羰基-β-乙酰乳香酸在0.021～0.513 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.4 檢測限與定量限試驗 以信噪比分別為3∶1和10∶1測得本法的檢出限和定量限分別為0.21 μg/mL和0.63 μg/mL。

2.2.3.5 精密度試驗 精密吸取濃度為0.205 mg/mL的對照品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進樣6次，進樣量10μL，測定峰面積，峰面積的RSD為0.5%，表明所用儀器具良好的精密度。

2.2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批的樣品(編號：0194)，分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液各6份，分別精密吸取10μL，在2.2.1項色譜條件下測定，測定色譜峰面積，計算的11-羰基-β-乙酰乳香酸平均值為1.0872 mg/g，RSD為1.7%，表明本方法具有良好的重復(fù)性。2.2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品(編號：0194)按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12、18 h進樣，測定色譜峰面積，峰面積RSD為1.9%，表明樣品在18 h內(nèi)穩(wěn)定，供試品溶液中待測組分化學性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品(編號： 0194，11-羰基-β-乙酰乳香酸含量為1.0872 mg/g)，將11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品溶液分別按供試品中11-羰基-β-乙酰乳香酸含量的80%、100%、120%精密加入，各3份，按供試品溶液制備方法制備高、中、低濃度9份供試品溶液，精密吸取10 μL，依法測定，本方法回收率在101.60%～104.73%之間，RSD為0.9%。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.4 供試品測定 取3個廠家共22批供試品(均為大蜜丸)，按供試品溶液制備方法制備制成供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，再按2.2.1項色譜條件下測定，記錄色譜圖(如圖4所示)，測定峰面積，可知11-羰基-β-乙酰乳香酸含量為2.0674 mg/丸～4.1242 mg/丸，平均含量為3.1996 mg/丸。測定結(jié)果見表3。

表3 供試品中11-羰基-β-乙酰乳香酸含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜法中條件的優(yōu)化 照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述供試品溶液2～5 μL和對照品溶液5 μL，①分別點于同一硅膠GF254薄層板上，②分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，a. 置紫外光燈(254 nm)下檢視，b. 噴以10%的硫酸乙醇后在紫外燈光366 nm和日光下檢視。通過對比，結(jié)果表明：①紫外光燈254 nm檢視，斑點清晰；②噴以10%的硫酸乙醇在紫外光燈365 nm檢視，斑點不明顯；③噴以10%的硫酸乙醇日光下檢視，斑點不明顯。由此可以看出：點于同一硅膠GF254薄層板上，在紫外光燈254 nm檢視方法最好。

3.2 提取時間考察 取同一批的樣品(編號：0194)，按供試品溶液制備方法制備，分別超聲處理10、20、30、40 min，取出，放冷，用乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，分別精密吸取10 μL，在上述色譜條件下測定，測定色譜峰面積，計算11-羰基-β-乙酰乳香酸含量，含量分別為0.6738、0.6988、1.0872、1.0880 mg/g。因此確定超聲提取時間為30 min。

乳香、制乳香在現(xiàn)行有效標準中多以測松香酸來鑒定其有無摻偽，測定乳香藥材、含乳香的中成藥中的11-羰基-β-乙酰乳香酸近幾年才見報道，本文建立了蘇合香丸中11-羰基-β-乙酰乳香酸的定性定量方法，方法學驗證實驗表明該方法操作簡單，結(jié)果準確，適用性良好，可以作為蘇合香丸現(xiàn)行法定檢驗標準的有益補充。

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