替格瑞洛對oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM—1表達(dá)的影響

劉華　康美尼　王興華

摘 要：目的 探究不同濃度的替格瑞洛對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在蛋白及RNA水平表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1的影響。方法 離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，平均接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時取三孔加入ox-LDL（50 μg/ml），再分別加入不同濃度的替格瑞洛（0、20、40 μmol/L）。刺激干預(yù)24 h后采用Western Blot法測定ICAM-1的蛋白表達(dá)水平。重復(fù)實驗，采用Real-time PCR法測定ICAM-1的RNA表達(dá)水平。結(jié)果 ①oxLDL能明顯上調(diào)ICAM-1的表達(dá)；②Western Blot蛋白定量結(jié)果顯示，oxLDL誘導(dǎo)組ICAM-1的蛋白表達(dá)明顯高于對應(yīng)的非誘導(dǎo)組（P<0.05）；未予替格瑞洛干預(yù)組ICAM-1的蛋白表達(dá)高于替格瑞洛低濃度組（P<0.05）；替格瑞洛低濃度組ICAM-1的蛋白表達(dá)高于替格瑞洛高濃度組（P<0.05）；③Real-time PCR結(jié)果與Western Blot蛋白定量結(jié)果一致。結(jié)論 oxLDL能在RNA水平提高ICAM-1表達(dá)，替格瑞洛能在RNA水平抑制ICAM-1的表達(dá)，并與濃度正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：替格瑞洛；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化型低密度脂蛋白；細(xì)胞間黏附分子-1

中圖分類號：R543 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.22.022

文章編號：1006-1959（2018）22-0081-04

Effect of Ticagrelor on the Expression of ICAM-1 in Human umbilical Vein Endothelial Cells Induced by oxLDL

LIU Hua1，2，KANG Mei-ni2，WANG Xing-hua2，LIANG Xue2，LI Guang-ping2

（1.Department of Cardiology，Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061000，Hebei，China；

2.Institute of Cardiology，Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

Abstract：Objective To investigate the effects of different concentrations of ticagrelor on the expression of intercellular adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein at protein and RNA levels.Methods Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro and seeded on a 6-well culture plate. When the cells were grown to the fusion state， ox-LDL （50 μg/ml） was added to the wells， and different concentrations of ticagrelor were added（0， 20， 40 μmol/L）. The protein expression level of ICAM-1 was determined by Western Blot after 24 h of stimulation. The experiment was repeated and the RNA expression level of ICAM-1 was determined by Real-time PCR. Results ①oxLDL could up-regulate the expression of ICAM-1.②Western Blot protein quantitation results showed that the protein expression of ICAM-1 in oxLDL-induced group was significantly higher than that in the corresponding non-inducing group（P<0.05）；The protein expression of ICAM-1 in the Ticagrelor-free group was higher than that in the tigrisin group （P<0.05）. The protein expression of ICAM-1 in the low-concentration group was higher than that in the Ticagrelor group（P<0.05）； ③Real-time PCR results were consistent with Western Blot protein quantitation results. Conclusion oxLDL can increase the expression of ICAM-1 at the RNA level， and ticagrelor can inhibit the expression of ICAM-1 at the RNA level， and it is positively correlated with the concentration.

Key words：Ticagrelor；Human umbilical vein endothelial cells；Oxidized low density lipoprotein； Intercellular adhesion molecule-1

隨著近年來信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控水平的研究，動脈粥樣硬化發(fā)病機制愈發(fā)傾向于炎癥損傷應(yīng)答學(xué)說。粘附分子是炎癥的始動因子和標(biāo)志物，在動脈粥樣硬化早期炎癥中起著重要的作用。黏附分子-1（ICAM-1）是一種非常重要的具有代表性的粘附因子，在靜息的內(nèi)皮細(xì)胞上呈低水平表達(dá)或不表達(dá)，但在氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）等炎性損傷因子刺激下能迅速上調(diào)，導(dǎo)致白細(xì)胞停止?jié)L動粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致一系列心血管病理改變。替格瑞洛（Tigeralor）作為新型抗血小板藥物，在發(fā)揮抗血小板作用的同時，同時是否具有抗炎癥損傷作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）CRL-1730由天津市心血管疾病研究所贈與，其培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM-F12。

1.1.2主要試劑 DMEM-12培養(yǎng)基（GIBC，美國）；oxLDL（北京欣源佳和生物科技有限公司，北京）；Tigeralor原粉（上海鉑力生物科技有限公司，上海）；鼠抗ICAM-1單抗（北京中山金橋，北京）；鼠抗GAPDH單克隆IgG（Abcam，USA）；Page Rulert Prestained Protein Ladder（Fermentas，USA）；引物序列ICAM-1（Forward 5'-CCCTTCCCCCCAAAACTG-3' Rerverse 5'-GTCATTGTGAACACTGGCAGAAA-3'）β-actin（Forward 5'-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3'Reverse 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'）英淮捷基貿(mào)易有限公司設(shè)計合成。

1.1.2主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，江蘇）；Eppendorf低溫離心機（eppendorf，德國）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Forma，USA）；6孔培養(yǎng)板（Corning，USA）；微量移液管（Brand accu-jet，USA）；紫外可見光分光光度計（Eppendrof，USA）；電子天平（北京多賽斯儀器系統(tǒng)有限公司，北京）；MilliQ超純水系統(tǒng)（Milipore， 法國）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（Becton，Dickinson and Company，USA）；電轉(zhuǎn)膜儀（Becton，Dickinson and Company，USA）；水平搖床（Becton，Dickinson and Company，USA）；ABi7500實時定量PCR儀（ABI，美國）。

1.2方法

1.2.1 HUVECs細(xì)胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 從液氮罐取出凍存管，37 ℃水浴中融化后，離心棄上清；加入12 ml10%FBS，1%雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)液，混勻后移入細(xì)胞培養(yǎng)皿；觀察細(xì)胞數(shù)量狀態(tài)，將培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，次日待細(xì)胞貼壁后，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)鏡下細(xì)胞密度達(dá)80%可進(jìn)行細(xì)胞胰酶消化傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)2～3代后，將狀態(tài)良好的細(xì)胞平均分裝于6孔培養(yǎng)板，待6孔板細(xì)胞密度達(dá)70%細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，進(jìn)行刺激和干預(yù)。

1.2.2 oxLDL刺激與替格瑞洛干預(yù) 將替格瑞洛原粉5 mg溶解于100 μl DMSO中，用培養(yǎng)液按1：100稀釋，得到濃度為1 μmol/ml的藥物干預(yù)液。向6孔板內(nèi)分別加入oxLDL及替格瑞洛，進(jìn)行刺激和干預(yù)。分組如下：1組：培養(yǎng)液1 ml，替格瑞洛0；2組：培養(yǎng)液1 ml，替格瑞洛20 μl（20 μmol/ml）；3組：培養(yǎng)液1 ml，替格瑞洛40 μl（40 μmol/ml）；4組：培養(yǎng)液1 ml，oxLDL38ul（50 μg/ml），替格瑞洛0；5組：培養(yǎng)液1 ml，oxLDL38ul（50 μg/ml），替格瑞洛20 μl（20 μmol/ml）；6組：培養(yǎng)液1ml，oxLDL38 μl（50 μg/ml），替格瑞洛40 μl（40 μmol/ml）。其中1～3組為非oxLDL誘導(dǎo)組，4～6組為oxLDL誘導(dǎo)組。將6孔板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 Western Blot蛋白定量 分別提取各組蛋白，采用Western Blot進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、曝光后取得膠片。膠片用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)對目的條帶和GAPDH（持家基因內(nèi)參）條帶進(jìn)行攝像，測量條帶的灰度值；比較各組校準(zhǔn)后蛋白條帶灰度值的關(guān)系，并以未經(jīng)刺激干預(yù)組為其標(biāo)準(zhǔn)值，計算各組條帶相對灰度值并繪制柱狀圖。

1.2.4實時定量PCR 分別提取RNA，先反轉(zhuǎn)錄DNA，再以Real-time PCR法進(jìn)行RNA定量測定。引物序列：ICAM-1 Forward：5'-CCCTTCCCCCCAAAACTG-3' Rerverse：5'-GTCATTGTGAACACTGGCAGAAA-3'；β-actin Forward：5'-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3' Reverse：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'。Real-time PCR反應(yīng)40個循環(huán)后，自帶軟件自動進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制柱狀圖：Folds=2-ΔΔCt；ΔΔCt=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4）；Ct1=處理樣品待測基因的臨界循環(huán)數(shù)；Ct2=處理樣品持家基因β-actin的臨界循環(huán)數(shù)；Ct3=對照樣品待測基因的臨界循環(huán)數(shù)；Ct4=對照樣品持家基因β-actin的臨界循環(huán)數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計 重復(fù)試驗，采用SPSS16.0軟件，計量資料以（x±s）表示，多組樣本平均數(shù)的比較采用采用舉因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot蛋白定量結(jié)果 oxLDL誘導(dǎo)組ICAM-1的蛋白表達(dá)高于對應(yīng)的非誘導(dǎo)組（P<0.05）；未予替格瑞洛干預(yù)組ICAM-1的蛋白表達(dá)替格瑞洛低濃度組（P<0.05）；替格瑞洛低濃度組ICAM-1的蛋白表達(dá)高于替格瑞洛高濃度組（P<0.05），見表1、圖1。

2.2 Real-time PCR結(jié)果 oxLDL誘導(dǎo)組ICAM-1的蛋白表達(dá)高于對應(yīng)的非誘導(dǎo)組；未予替格瑞洛干預(yù)組ICAM-1的蛋白表達(dá)替格瑞洛低濃度組；替格瑞洛低濃度組ICAM-1的蛋白表達(dá)替格瑞洛高濃度組。結(jié)果與WesternBlot蛋白定量一致，見圖2、表2。

3討論

隨著近年來信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控水平的研究，動脈粥樣硬化發(fā)病機制愈發(fā)傾向于炎癥損傷應(yīng)答學(xué)說。粘附分子是炎癥的始動因子和標(biāo)志物，在動脈粥樣硬化早期炎癥中起著重要的作用，是多種血管損傷途徑的共同通路[1-3]。ICAM-1作為重要的粘附因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最高，其次為外周白細(xì)胞。在靜息內(nèi)皮細(xì)胞上呈低水平表達(dá)或不表達(dá)，在TNF-α、oxLDL、IL等炎性損傷因子刺激下迅速上調(diào)[4]。ICAM-1與P-selectin、E-selecin作用后，與整合素家族CD11a/CD18高親和相互作用，導(dǎo)致白細(xì)胞停止?jié)L動，穩(wěn)定粘附于內(nèi)皮細(xì)胞。血管內(nèi)皮、心肌細(xì)胞與白細(xì)胞相互激活，產(chǎn)生和釋放氧自由基和血管活性物質(zhì)等因子，形成炎癥瀑布，導(dǎo)致血管損傷，產(chǎn)生一系列病理改變[5]。心血管藥物的抗炎癥損傷作用一直是研究熱點。既往研究表明，許多心血管藥物在發(fā)揮其他藥物作用的同時還有抗炎癥損傷作用。替格瑞洛不需要代謝活化便可拮抗 ADP介導(dǎo)血小板聚集作用，起效更迅速[6]，可以改善ACS和PCI治療的療效，以及限制死亡率和心血管事件的發(fā)生率[7，8]。此外，替格瑞洛屬于碳環(huán)核苷類藥物，它還通過增加血液中腺苷濃度使心血管患者受益[9]。

本研究顯示，oxLDL能在RNA水平提高ICAM-1表達(dá)；替格瑞洛能在RNA水平抑制ICAM-1的表達(dá)，并與濃度正相關(guān)。替格瑞洛能夠在RNA水平下調(diào)ICAM-1因子，進(jìn)而減少血管內(nèi)皮與白細(xì)胞的粘附作用，減少血管內(nèi)皮損傷改善患者預(yù)后，與其他相關(guān)研究相符合[10]。替格瑞洛藥物多效性可能會為心血管系統(tǒng)疾病的預(yù)防治療提供新的思路。

綜上所述，替格瑞洛在發(fā)揮抗血小板作用的同時，還能夠在RNA水平抑制粘附因子ICAM-1的表達(dá)，具有抗炎癥損傷的作用，進(jìn)而減少血管內(nèi)皮損傷改善患者預(yù)后。

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收稿日期：2018-7-1；修回日期：2018-8-1

編輯/雷華