高效液相色譜法測定鉻超富集植物李氏禾根系分泌物中的有機酸

伍嬋翠, 劉 杰, 張學(xué)洪

(1. 桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 廣西 桂林 541004; 2. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院, 廣西 南寧 530004; 3. 桂林理工大學(xué), 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室, 廣西 桂林 541004)

大多數(shù)植物根系都能夠分泌出低相對分子質(zhì)量的有機酸,如檸檬酸、蘋果酸和草酸[1]。這些有機酸既能在土壤固相中,又能在根際土壤溶液中與金屬離子發(fā)生反應(yīng),增加金屬在根際環(huán)境中的流動性,從而提高重金屬的植物有效性[2]。在超富集植物中,根系分泌的有機酸還可增加土壤中金屬離子的溶解度,并與根系分泌物中的某些物質(zhì)形成穩(wěn)定的金屬螯合物復(fù)合體,從而減輕重金屬對植物的毒害作用[3]。有機酸也被認(rèn)為參與了有毒金屬元素的耐受和富集[4]。因此,根系中有機酸的分析對于深入認(rèn)識超富集植物的生理生態(tài)學(xué)適應(yīng)機制顯得尤其重要。

采用不同方法檢測植物根系中有機酸的研究已有報道。趙寬等[5]建立了植物根莖葉及根系分泌物中有機酸的離子色譜分析測定方法,并從4種不同植物的根系分泌物中檢測出草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸和丁二酸。鄢盛堯等[6]采用酶動力學(xué)分光光度法測定油茶根系分泌物中的檸檬酸和蘋果酸。張力等[7]利用飛行時間質(zhì)譜測定了樟樹幼苗根系分泌物中的低相對分子質(zhì)量有機酸。這些儀器分析方法在使用中都存在一定的問題:離子色譜法易受介質(zhì)干擾,對樣品的要求較高;酶動力學(xué)分光光度法測量誤差較大,影響因素較多;飛行時間質(zhì)譜法因離子在離開離子源時初始能量不同,使得具有相同質(zhì)荷比的離子達(dá)到檢測器時有一定的時間分布,易造成分辨能力下降。此外,根系分泌物有200多種,其種類和數(shù)量隨植物類型、根際環(huán)境而異[8]。植物間親緣關(guān)系越遠(yuǎn),根系分泌物組分和數(shù)量差異越大,根系分泌物的種類和數(shù)量還隨外界環(huán)境脅迫的不同而改變[9]。李氏禾(LeersiahexandraSwartz)是國內(nèi)首次報道的鉻超富集植物[10],它對土壤中的鉻有很強的吸收和富集能力[11]。目前,對鉻超富集植物根系分泌物中有機酸成分的分析尚未見報道。其根系分泌物中的有機酸,可以在一定程度上改變土壤中鉻的溶解度[12],能與土壤固、液相中的金屬離子發(fā)生強烈反應(yīng),對李氏禾吸收和耐受土壤中的鉻污染物起到了至關(guān)重要的作用。

本文以李氏禾的根系分泌物為研究對象,采用高效液相色譜(HPLC),通過對檢測條件的優(yōu)化,旨在建立一個準(zhǔn)確、快捷的方法同時檢測李氏禾根系分泌物中的低相對分子質(zhì)量有機酸組分。此外,本研究采用溶液收集法獲取李氏禾的根系分泌物,與土培收集法[13]和原位收集法[14]相比,操作簡單,易于進(jìn)一步分析。與現(xiàn)有文獻(xiàn)[13,15]相比,收集到的根系分泌物無需通過離子交換樹脂和萃取等前處理,濃縮后即可適用于定量分析。本研究的檢測結(jié)果將會對進(jìn)一步研究李氏禾對鉻的耐受機制、解毒機制和富集機制提供重要的信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜系統(tǒng)(515泵,717 plus自動進(jìn)樣器, 2996紫外吸收檢測器,Empower色譜工作站,美國Waters公司); UPW-20N超純水器(北京歷元電子儀器); LRH-550-GSI人工氣候箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司); RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); PHS-3C酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);水相針式過濾器(直徑13 mm,孔徑為0.45 μm,天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)。

草酸(oxalic acid)、甲酸(formic acid)、乙酸(acetic acid)、乳酸(lactic acid)、酒石酸(tartaric acid)、檸檬酸(citric acid)、蘋果酸(malic acid)、馬來酸(maleic acid),均為標(biāo)準(zhǔn)品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司);其他化學(xué)試劑均為分析純(中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司);實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

XSelect HSS T3色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Waters公司);流動相為40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.40);流速1.0 mL/min;檢測波長205 nm;柱溫25 ℃。

1.3 實驗條件

1.3.1 植物材料

李氏禾適合生長在溪旁、稻田和沼澤地里[10]。本次實驗用的李氏禾采至桂林市靈川縣靈田鄉(xiāng)花江邊上。其生長茂盛且分布廣泛,是本實驗理想的實驗材料。

1.3.2 植物培養(yǎng)

選取生長一致的李氏禾幼苗,用去離子水洗凈,放入含有1.5 L 25% (體積分?jǐn)?shù)) Hoagland’s營養(yǎng)液的塑料盆中,于人工氣候箱中培養(yǎng)10 d。每天加入去離子水保持培養(yǎng)液的體積,每3天更換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為:光周期12 h,溫度25 ℃,相對濕度75%,光照強度7 000 Lx。

1.3.3 根分泌物的收集

第十天光照2 h后將李氏禾取出,先用蒸餾水沖洗根部3次,在新制備的超純水中加入幾滴0.05%(體積分?jǐn)?shù))的百里酚水溶液[16],浸泡李氏禾根部5 min,再用超純水清洗根部3次。將李氏禾放入300 mL 0.5 mmol/L的CaCl2溶液中[17],每杯加入3滴0.05%(體積分?jǐn)?shù))的百里酚溶液,放回培養(yǎng)箱中光照收集4 h。4 h后,收集液用0.45 μm的濾膜抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40 ℃, 90 r/min)濃縮后,再用氮氣吹干,最后定容至2 mL,放于冰箱中冷藏備用。

1.3.4 有機酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取草酸、檸檬酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸各0.500 0 g,分別用超純水溶解并定容至10 mL;用移液槍移取甲酸、乙酸、乳酸各5.0 mL,分別用超純水定容至25、50、50 mL。放置于冰箱中保存,檢測時用現(xiàn)配的流動相稀釋成所需濃度。

圖 1 不同流動相條件下8種有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of mixed standard solutions of eight organic acids with different mobile phases a. mobile phase: acetonitrile-water (10∶90, v/v) (pH=3.00); b. mobile phase: 40 mmol/L KH2PO4 buffered aqueous solution (pH=2.40).

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜流動相的優(yōu)化

2.1.1 流動相的組成

現(xiàn)有的采用高效液相色譜法檢測有機酸的報道中有的采用有機試劑做流動相[18],有的采用無機溶液及緩沖溶液做流動相[19-21]。本研究分別選擇了乙腈-水溶液和KH2PO4-H3PO4磷酸緩沖溶液作為流動相,以比較兩者對混合有機酸的分離效果。實驗結(jié)果表明,采用乙腈-水(10∶90,體積比)溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.00)作為流動相并不能對8種有機酸進(jìn)行有效分離(見圖1a)。故本實驗考慮采用KH2PO4-H3PO4緩沖溶液作為流動相。

2.1.2 流動相的濃度

分別配制了10、20、30、40、50 mmol/L KH2PO4溶液(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.40),以考察不同濃度對分離效果的影響。實驗結(jié)果表明,當(dāng)KH2PO4溶液的濃度小于40 mmol/L時,酒石酸和甲酸、乳酸和乙酸不能有效分離;當(dāng)KH2PO4溶液的濃度為40 mmol/L和50 mmol/L時,分離效果無明顯區(qū)別,8種有機酸能較好地實現(xiàn)分離。從節(jié)約成本的角度考慮,選擇40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液作為流動相。

2.1.3 流動相的pH值

用H3PO4分別將流動相的pH值調(diào)節(jié)至2.20、2.40和2.60,以考察pH值對分離效果的影響。實驗結(jié)果表明,pH值為2.20時出峰較慢,峰形較寬;pH值為2.40時各有機酸分離效果最佳(見圖1b); pH值為2.60時酒石酸和甲酸分離效果不理想。因此,選擇40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.40)作為流動相。

2.2 檢測波長

檢測波長是影響峰響應(yīng)值的一個重要因素。基于有機酸在200～240 nm范圍內(nèi)有較強的紫外吸收,本研究考察了205、220和230 nm 3個波長。實驗結(jié)果(見圖2)表明,8種有機酸在205 nm波長處均有最大吸收峰,故本實驗選用205 nm為檢測波長。

圖 2 不同波長下有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of a mixed standard solution at different wavelengths

2.3 流速

其他條件不變,分別以1.2、1.0、0.8和0.6 mL/min的流動相流速對有機酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。實驗結(jié)果表明,流速高于1.0 mL/min時柱壓明顯升高,當(dāng)流速為1.2 mL/min時柱壓約14.5 MPa;流速低于1.0 mL/min,分離時間不斷延長。綜合考慮分析時間和色譜柱柱壓兩個因素,最終選擇最佳流速為1.0 mL/min, 8種有機酸能在13 min內(nèi)完成很好的分離。

經(jīng)優(yōu)化后,在13 min內(nèi)即可分離出8種有機酸,且峰形良好。因此,本實驗的最佳色譜條件確定如下:以40 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=2.40)為流動相,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,在波長205 nm處紫外檢測。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

根據(jù)前述實驗步驟和條件,將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液依次等體積進(jìn)樣,以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x, mg/L)進(jìn)行線性回歸,8種有機酸的線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)(R2)、線性范圍見表1。對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋,取S/N=3時組分的質(zhì)量濃度為檢出限(見表1)。

2.4.2 回收率和精密度

為檢驗該方法的準(zhǔn)確性,分別進(jìn)行了回收率試驗和精密度試驗。在優(yōu)化的條件下對李氏禾根系分泌物樣本進(jìn)行檢測，樣本中各有機酸背景值見表2。

表 1 各有機酸的線性關(guān)系和檢出限Table 1 Linear relationships and limits of detection (LODs) of the organic acids

*y: peak area;x: mass concentration, mg/L. ** LODs were determined based on signal to noise ratio of 3 (S/N=3).

表 2 根分泌物中有機酸的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recoveries and precisions of the organic acids spiked in the root exudate sample (n=5)

n.d.: not detected.

向樣本中分別添加高、中、低濃度的各有機酸,在優(yōu)化的色譜條件下測定并計算各有機酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),平行測定5次。實驗結(jié)果(見表2)表明,除草酸外,其余各有機酸的回收率為94.54%～109.98%。精密度均在可接受的范圍內(nèi)。充分證明了該方法的準(zhǔn)確性。該方法的線性范圍及分析結(jié)果的精密度和回收率都能滿足植物根系分泌物中有機酸定性和定量分析的要求。

2.5 樣品的測定

采用優(yōu)化后所確定的方法對李氏禾根系分泌物中的有機酸成分進(jìn)行檢測,根據(jù)保留時間對樣品的色譜峰定性。用于根分泌物收集的0.5 mmol/L CaCl2溶液也通過同樣的方法預(yù)處理后進(jìn)行檢測。將植物根系分泌物樣品的色譜圖同CaCl2溶液的色譜圖作對比(見圖3),確定3.035 min的色譜峰為溶劑峰。由于溶劑峰的保留時間與草酸非常接近,雖然對草酸的定性分析沒有影響,但卻在一定程度上影響了草酸定量分析的準(zhǔn)確性。這也是草酸的加標(biāo)回收率在74%左右的原因。在后續(xù)的研究中可嘗試降低CaCl2的濃度,或用超純水代替CaCl2溶液作為收集液,或在收集過程中增加曝氣[22],以消除溶劑峰對檢測結(jié)果的干擾。

圖 3 (a)根系分泌物樣品和(b)用于根分泌物收集的0.5 mmol/L CaCl2溶液的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of (a) the sample of rootexudates and (b) 0.5 mmol/L CaCl2 solution used for root exudates collection

結(jié)果表明,李氏禾根系分泌物中可檢測出草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、馬來酸和檸檬酸6種有機酸。考慮到溶劑峰對草酸定量分析準(zhǔn)確性的影響,只對其進(jìn)行定性,不計算其含量。其余5種有機酸含量分別為酒石酸(130.90±1.44) μg/g(根干重)、蘋果酸(1 031.34±4.38) μg/g(根干重)、乳酸(65.54±1.01) μg/g(根干重)、馬來酸(0.960 00±0.003 67) μg/g(根干重)和檸檬酸(201.50±1.13) μg/g(根干重)。其中蘋果酸含量最高,馬來酸含量最低。另外,甲酸和乙酸未檢出。由此可見,蘋果酸是李氏禾根系分泌物有機酸中的優(yōu)勢組分。另外,檸檬酸和酒石酸也大量存在于李氏禾的根系分泌物中。

3 結(jié)論

本方法的建立為鉻超富集植物根系分泌物中有機酸的研究提供了重要的檢測手段。本方法可應(yīng)用于后期研究中,以考察不同營養(yǎng)條件及脅迫條件下李氏禾根分泌物中有機酸成分的變化。檢測結(jié)果對進(jìn)一步探尋根系分泌物中有機酸對鉻的作用機理,以及李氏禾對鉻的耐受機制、解毒機制和富集機制都將具有重要意義。

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