表面接枝親水性聚合物刷磁性微球的制備及其對(duì)蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留的磁分散固相萃取

周少丹, 唐嘉琦, 賈 博, 呂運(yùn)開(kāi)

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 保定 071002)

四環(huán)素類抗生素(tetracycline antibiotics, TCs)具有廣譜抗菌性,在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中常被作為飼料添加劑用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病。近年來(lái),畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的不合理使用和濫用現(xiàn)象十分普遍,而可食用性動(dòng)物組織中抗生素及其代謝物殘留對(duì)人類健康存在潛在危害。攝入過(guò)量含抗生素的動(dòng)物源食品會(huì)使人發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，產(chǎn)生耐藥性。因此,抗生素殘留問(wèn)題引發(fā)了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)[1]、歐盟[2]和中國(guó)農(nóng)業(yè)部[3]均規(guī)定TCs在動(dòng)物源食品中的最大殘留限量(MRL)為0.10 mg/kg。

食品中四環(huán)素類抗生素殘留的主要檢測(cè)方法有色譜法[4-6]及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7,8],而樣品前處理步驟是影響檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前檢測(cè)TCs殘留的前處理方法主要是固相萃取技術(shù)[5,6,9]。盡管固相萃取技術(shù)具有溶劑用量小、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),但仍存在萃取過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)[9]。磁分散固相萃取(magnetic dispersion solid phase extraction, MDSPE)技術(shù)[9-11]因其簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)得到了迅速發(fā)展,其研究核心是功能化磁性微球(MMs)的制備。在前期研究[12-15]中發(fā)現(xiàn)親水性磁性微球可以使微球表面形成一個(gè)有效的親水層,提高了水相體系的相容性和樣品凈化能力(主要是表面水合層抑制了生物大分子的吸附)，但表面接枝層的厚度仍影響實(shí)際樣品的凈化效果。為了提高凈化效果,本工作在磁性微球表面接枝了雙功能聚合物刷，合成了親水性聚合物刷磁性微球(HMMs),以解決親水層厚度低的問(wèn)題,實(shí)現(xiàn)了尺寸排阻生物大分子。

目前合成親水性聚合物刷磁性微球常用的方法有可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合法(RAFT)[16]、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)[17]和電子轉(zhuǎn)移活化再生催化劑原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ARGET-ATRP)[18]。RAFT適用于聚合較不活潑的單體,但采用RAFT聚合時(shí)難以控制反應(yīng)程度與產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量;ATRP適用的單體較多,可進(jìn)行本體、溶液、乳液、懸浮等聚合,但存在催化劑易被氧化、用量大、聚合后難脫除等問(wèn)題;ARGET-ATRP既可以控制聚合物刷的相對(duì)分子質(zhì)量,又解決了ATRP需嚴(yán)格無(wú)氧的苛刻條件,引起了研究者的極大興趣[18]。

本文采用ARGET-ATRP制備了內(nèi)層為聚堿類聚合物、外層為親水性聚合物刷的磁性微球,并利用磁分散固相萃取-高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定蜂蜜中的鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride, TC)、鹽酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride, CTC)和鹽酸強(qiáng)力霉素(doxycycline hydrochloride, DC)殘留。通過(guò)優(yōu)化MDSPE萃取條件(上樣溶液的pH、萃取時(shí)間、淋洗液和洗脫劑),發(fā)展了一種快速分離、富集、檢測(cè)蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀、TGA-50熱重分析儀、UV-3600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司); JEM-100SX透射電子顯微鏡(日本電氣股份有限公司); Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

四水合二氯化亞鐵(FeCl254H2O)、六水合三氯化鐵(FeCl356H2O)、乙醇、氫氧化鈉、油酸、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水、鹽酸、甲苯、二氯甲烷和三乙胺均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙酸、乙酸乙酯、草酸、乙腈、二水乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA52H2O)、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸和硼酸均購(gòu)自天津市東華試劑廠;四氫呋喃購(gòu)自天津市進(jìn)豐化工有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自北京欣惠澤莫科技有限公司；2-溴異丁酰溴、溶菌酶(lysozyme, LZM)和魚(yú)精蛋白(protamine, PRM)均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氫化鈣(CaH2)、溴化銅(CuBr2)、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA)、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(poly(ethylene glycol) methacrylate, PEGMA,Mr=400)、異辛酸亞錫(Sn(Oct)2)均購(gòu)自上海麥克林生化有限公司;五甲基二乙烯基三胺(N,N,N′,N″,N″-pentamethyl diethylene triamine, PMDETA)購(gòu)自瑪雅試劑;3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-amino propyl) triethoxy silane, APTES)購(gòu)自上海邦成化工有限公司;TC、CTC和DC均購(gòu)自美國(guó)Fluka公司。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。蜂蜜購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 溶液的配制

Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.00±0.05):將6.45 g檸檬酸、13.80 g磷酸氫二鈉、18.60 g二水乙二胺四乙酸二鈉鹽用水溶解并定容至500 mL。

Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(0.10 mol/L):稱取60.50 g二水乙二胺四乙酸二鈉,加入1 625.0 mL Mcllvaine緩沖溶液,溶解,搖勻。

伯瑞坦-羅賓森(Britton-Robinson, B-R)緩沖溶液Ⅰ(pH 6.00±0.10):在100.0 mL濃度均為0.04 mol/L的磷酸、乙酸和硼酸混合溶液中加入42.5 mL 0.20 mol/L NaOH溶液。

B-R緩沖溶液Ⅱ(pH 10.00±0.10):在100.0 mL濃度均為0.04 mol/L的磷酸、乙酸和硼酸混合溶液中加入77.5 mL 0.20 mol/L NaOH溶液。

考馬斯亮藍(lán)試劑的配制：稱取10 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于5 mL 95%(v/v)乙醇水溶液中，然后與10 mL 85%(v/v)磷酸水溶液混合，用蒸餾水定容至100 mL,濾紙過(guò)濾，待用。

TCs標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.00 g/L):準(zhǔn)確稱取0.01 g TC、CTC和DC標(biāo)準(zhǔn)品,加入少量甲醇溶解,然后轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,保存于4 ℃冰箱中(不超過(guò)3個(gè)月)。

試劑處理：DEAEMA用CaH2干燥48 h,減壓蒸餾后儲(chǔ)存于-20 ℃冰柜中；PEGMA過(guò)中性氧化鋁層析柱，除去阻聚劑后密封待用；甲苯、三乙胺、二氯甲烷等均經(jīng)干燥處理，待用。

1.3 親水性聚合物刷磁性微球的制備

1.3.1 磁性微球的制備

采用共沉淀法合成磁性微球。稱取2.00 g FeCl254H2O和5.20 g FeCl356H2O,加入100.0 mL去離子水,機(jī)械攪拌使其充分溶解,在氮?dú)鈼l件下加熱至80 ℃,將40.0 mL 0.20 mol/L氫氧化鈉溶液逐滴滴加到混合物中,溶液由棕黃色變?yōu)楹谏髮?.0 mL油酸滴加到溶液中,于80 ℃恒溫反應(yīng)1 h,用乙醇和蒸餾水分別洗滌產(chǎn)物3次,除去未反應(yīng)的化合物,于60 ℃下干燥12 h,得到Fe3O4磁性微球(Fe3O4-MMs)。

1.3.2 硅膠包覆磁性微球的制備

利用溶膠-凝膠法合成硅膠包覆的磁性微球。取1.00 g Fe3O4-MMs,加入80.0 mL乙醇、25.0 mL蒸餾水和2.5 mL氨水,超聲分散5 min。在機(jī)械攪拌條件下將1.0 mL TEOS與20.0 mL乙醇的混合溶液逐滴加入上述體系中,超聲分散5 min。于35 ℃機(jī)械攪拌12 h,收集產(chǎn)物。用乙醇和蒸餾水分別洗滌3次,再用1.00 mol/L的鹽酸浸泡12 h,用蒸餾水洗滌至中性,于60 ℃干燥12 h。然后于150 ℃真空干燥箱中活化3 h,除去微球表面的締合水,得到硅膠包覆的磁性微球MMs@SiO2。將制備好的MMs@SiO2保存在真空干燥器中。

1.3.3 氨基功能化磁性微球的制備

通過(guò)甲苯回流法制備氨基功能化磁性微球。稱取1.00 g MMs@SiO2,加入100.0 mL甲苯,超聲分散,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,加入10.0 mL APTES,超聲5 min,于110 ℃機(jī)械攪拌條件下回流反應(yīng)24 h。產(chǎn)物通過(guò)磁鐵分離,用乙醇和蒸餾水分別洗滌3次,于40 ℃真空干燥箱中干燥12 h,最后得到氨基功能化磁性微球MMs@SiO2-NH2。

1.3.4 磁性微球表面接枝引發(fā)劑

在干燥的250 mL圓底燒瓶中加入70.0 mL二氯甲烷,將1.00 g干燥的MMs@SiO2-NH2磁性微球超聲分散于二氯甲烷中。加入2.0 mL干燥的三乙胺,并用冰水浴將體系冷卻至0 ℃。將2.0 mL 2-溴異丁酰溴溶于30.0 mL二氯甲烷中。在冰水浴和機(jī)械攪拌條件下,將上述混合溶液逐滴加入圓底燒瓶中,混合體系在冰水浴條件下繼續(xù)機(jī)械攪拌反應(yīng)2 h,然后撤去冰浴,在室溫條件下機(jī)械攪拌12 h。反應(yīng)結(jié)束后,得到的產(chǎn)物依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水洗滌數(shù)次,于40 ℃真空干燥箱中干燥12 h,制備得到表面接枝引發(fā)劑的磁性微球MMs-initiator，將其保存在真空干燥器中。

1.3.5 聚合物刷磁性微球的制備

參照文獻(xiàn)[19]中親水嵌段膠束的合成方法,在磁性微球表面接枝了聚堿類聚合物和聚乙二醇刷。在100 mL干燥圓底燒瓶中加入1.00 g MMs-initiator和0.09 g CuBr2,密封反應(yīng)瓶,通N2排盡空氣。依次將90.0 mL無(wú)水甲苯、19.5 mL DEAEMA單體和835 μL PMDETA配體加入反應(yīng)瓶中,攪拌10 min,使催化劑配合物Cu-PMDETA形成。隨后將1.3 mL還原劑Sn(Oct)2溶于10.0 mL甲苯中,混合均勻后加入反應(yīng)瓶中,機(jī)械攪拌5 min,然后將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)入70 ℃油浴中,機(jī)械攪拌反應(yīng)7 h。為了對(duì)比研究的需要,反應(yīng)7 h后,取出一部分冷卻至室溫,依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水洗滌3次,于40 ℃真空干燥箱中干燥12 h,獲得的產(chǎn)物為接枝了聚堿類聚合物的磁性微球DMMs。在余下的反應(yīng)體系中,加入8.3 mL PEGMA,連續(xù)聚合8 h后,冷卻至室溫,得到內(nèi)層為聚堿類聚合物、外層為親水性聚合物刷的磁性微球HMMs。將HMMs依次用無(wú)水乙醇和蒸餾水洗滌3次,于40 ℃真空干燥箱中干燥12 h后,保存在真空干燥器中。

1.4 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

將20 mg DMMs和HMMs分別置于25 mL具塞錐形瓶中,依次用3.0 mL甲醇和3.0 mL高純水進(jìn)行洗滌活化,然后在10.0 mL含有不同質(zhì)量濃度(0.01～0.20 g/L)TC的B-R緩沖溶液Ⅰ中進(jìn)行吸附試驗(yàn),室溫下?lián)u床振蕩萃取60 min。萃取結(jié)束后,經(jīng)磁分離,用紫外分光光度計(jì)在365 nm處檢測(cè)萃取后各溶液中TC的質(zhì)量濃度。

分別稱取10 mg LZM和PRM，用10 mL B-R緩沖液Ⅱ溶解，按照上述步驟萃取后，移取上清液0.1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，振蕩混勻，在595 nm處檢測(cè)各蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

通過(guò)公式Q=V(Co-Ce)/m計(jì)算平衡吸附容量Q(mg/g),其中，V(mL)是溶液的體積；Co(g/L)和Ce(g/L)分別是溶液中藥物的初始質(zhì)量濃度和萃取平衡后的質(zhì)量濃度；m(mg)為聚合物刷磁性微球的質(zhì)量。

1.5 樣品前處理

稱取5.00 g蜂蜜樣品,置于錐形瓶中,加入25.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液,樣品完全溶解后,旋蒸至1.0 mL左右。然后用B-R緩沖溶液Ⅰ定容至10.0 mL。

取20 mg HMMs置于錐形瓶中,依次用3.0 mL甲醇和3.0 mL水進(jìn)行活化,然后加入10.0 mL上述提取的樣品溶液,于室溫下振蕩萃取30 min,磁鐵分離后傾去上清液。用3.0 mL二氯甲烷淋洗HMMs,然后用3.0 mL B-R緩沖溶液Ⅱ進(jìn)行洗脫,磁鐵分離后,將洗脫液氮吹至近干,用1.0 mL流動(dòng)相重新溶解,經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后,待HPLC分析。

1.6 高效液相色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相A: 0.01 mol/L草酸溶液;流動(dòng)相B:乙腈-甲醇(1∶1, v/v)；梯度洗脫(具體條件見(jiàn)表1);流速:1.00 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):365 nm;進(jìn)樣量:20 μL。流動(dòng)相和樣品均經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后使用。

表 1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

A: 0.01 mol/L oxalic acid solution; B: acetonitrile-methanol (1∶1, v/v).

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物刷磁性微球的表征

圖1a～1c分別為Fe3O4-MMs、DMMs和HMMs的透射電鏡圖。由圖1a可知,制備的Fe3O4-MMs分布較為均勻,平均粒徑約為180 nm;由圖1b可知,在Fe3O4-MMs表面接枝了DEAEMA,其聚合物層的平均厚度為10 nm;由圖1c可知,繼續(xù)接枝PEGMA后,HMMs聚合物層的厚度達(dá)到40 nm。結(jié)果表明,HMMs被成功合成。

圖 1 (a)Fe3O4磁性微球、(b)聚堿類聚合物磁性微球和(c)親水性聚合物刷磁性微球的透射電鏡圖Fig. 1 Transmission electron microscopy images of (a) Fe3O4 magnetic microspheres (Fe3O4-MMs), (b) polybasic polymers magnetic microspheres (DMMs) and (c) hydrophilic polymer brushes magnetic microspheres (HMMs)

Fe3O4-MMs、MMs@SiO2、MMs@SiO2-NH2、MMs-initiator、DMMs和HMMs的傅里葉變換紅外光譜圖見(jiàn)圖2，通過(guò)傅里葉變換紅外光譜圖可以進(jìn)一步驗(yàn)證不同磁性微球表面基團(tuán)的接枝情況。從圖2a可以看出,在587 cm-1左右有吸收峰,這是Fe3O4-MMs中 Fe=O 的伸縮振動(dòng)峰,證明成功合成了Fe3O4-MMs;在1 094 cm-1和467 cm-1處分別為 Si-O-Si 的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,并且在587 cm-1處Fe3O4的特征峰變小,說(shuō)明硅膠成功包覆在Fe3O4磁性微球表面(見(jiàn)圖2b);與圖2b相比,圖2c中多了1 632 cm-1處 N-H 的伸縮振動(dòng)峰和2 963 cm-1處 -CH2- 的伸縮振動(dòng)峰,表明成功合成了MMs@SiO2-NH2;圖2d中,-Br的特征峰在700～500 cm-1附近,本實(shí)驗(yàn)中和Fe3O4的特征峰發(fā)生重合,故無(wú)法觀察到,但與圖2c相比,多了1 653 cm-1處酰胺基團(tuán)中 C=O 的伸縮振動(dòng)峰,證明在磁性微球表面成功接枝了2-溴異丁酰溴引發(fā)劑;圖2e中多了1 720 cm-1處的 C=O 伸縮振動(dòng)峰、1 380 cm-1處 -CH3的特征峰和1 459 cm-1處 -CH2- 的變形振動(dòng)峰,這些均表明成功制備了DMMs;從圖2f可以看出,3 443 cm-1處 O-H 的伸縮振動(dòng)峰、1 720 cm-1處 C=O 伸縮振動(dòng)峰、1 380 cm-1處 -CH3的特征峰和1 459 cm-1處 -CH2- 的變形振動(dòng)峰都明顯增大,從而證明成功合成了HMMs。

表征了不同磁性微球的熱穩(wěn)定性情況。Fe3O4-MMs、MMs@SiO2、MMs@SiO2-NH2、MMs-initiator、DMMs和HMMs的熱重分析圖見(jiàn)圖3。從圖3可以看出,Fe3O4-MMs和MMs@SiO2的質(zhì)量損失分別為4.64%和6.15%,表明了其穩(wěn)定性良好。MMs@SiO2-NH2有7.39%的質(zhì)量損失,而MMs-initiator的質(zhì)量損失達(dá)到11.36%,這就表明約有4.00%的2-溴異丁酰溴通過(guò)酰胺反應(yīng)接枝到磁性微球表面。從DMMs的熱重分析曲線可以看出,DMMs的質(zhì)量損失較大,可達(dá)到18.35%,可能是由于高分子聚合物聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEAEMA)的分解所致。接枝了PEGMA聚合物刷的HMMs在0～800 ℃之間質(zhì)量損失增加到32.73%。通過(guò)圖3的熱重曲線可知,樣品的質(zhì)量損失逐步增加,說(shuō)明每個(gè)步驟都反應(yīng)成功。

圖 3 不同磁性微球的熱重分析曲線Fig. 3 Thermogravimetric analysis curves of the different magnetic microspheres

2.2 靜態(tài)吸附考察

2.2.1 對(duì)TC的吸附性能考察

圖 4 DMMs和HMMs對(duì)(a)鹽酸四環(huán)素和(b)蛋白質(zhì)的吸附性能(n=3)Fig. 4 Adsorption performances of DMMs andHMMs for (a) tetracycline hydrochloride (TC) and (b) proteins (n=3) PRM: protamine; LZM: lysozyme.

圖4a為25 ℃時(shí),DMMs和HMMs對(duì)不同質(zhì)量濃度(0.01～0.20 g/L)TC溶液的吸附性能曲線。由圖4a可知,當(dāng)TC的質(zhì)量濃度小于0.05 g/L時(shí),HMMs對(duì)TC的吸附量隨著TC質(zhì)量濃度的增大而增大;當(dāng)TC的質(zhì)量濃度大于0.05 g/L時(shí),HMMs對(duì)TC的吸附量基本保持不變,說(shuō)明達(dá)到了吸附平衡,平衡時(shí)吸附量為10.51 mg/g。當(dāng)TC的質(zhì)量濃度大于0.05 g/L時(shí),DMMs對(duì)TC的吸附量仍處于增長(zhǎng)趨勢(shì),直至TC的質(zhì)量濃度為0.11 g/L后才達(dá)到吸附平衡。在達(dá)到吸附平衡時(shí),DMMs對(duì)TC的吸附量大于HMMs的吸附量,這是由于DMMs表面與TC存在著較強(qiáng)的靜電作用和疏水作用,接枝親水性聚合物刷后,降低了聚堿類聚合物和TC的作用位點(diǎn)。但HMMs的吸附量遠(yuǎn)大于實(shí)際樣品中TCs的含量。

2.2.2 對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能考察

采用1.4節(jié)靜態(tài)吸附的試驗(yàn)步驟,研究了DMMs和HMMs對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能。實(shí)驗(yàn)選用的蛋白質(zhì)為PRM和LZM,并利用考馬斯G-250法檢測(cè)萃取前、后蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果如圖4b所示:DMMs對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附,接枝了親水性聚合物刷后,吸附劑HMMs對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量明顯降低,表明HMMs對(duì)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出良好的排阻性能。這主要?dú)w因于親水長(zhǎng)鏈的彈簧效應(yīng),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)靠近并壓縮親水性長(zhǎng)鏈時(shí),長(zhǎng)鏈會(huì)像彈簧一樣對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生排斥作用,使得蛋白質(zhì)不能吸附在材料表面。隨著親水性長(zhǎng)鏈接枝密度增加以及鏈段長(zhǎng)度的增大,蛋白質(zhì)的吸附量會(huì)隨之減少[20]。

綜上所述，HMMs具有較好的樣品凈化能力和良好的吸附性能,因此本研究選擇HMMs為吸附劑進(jìn)行磁分散固相萃取,并用于實(shí)際樣品的分離分析研究。

圖 5 (a)上樣溶液的pH值、(b)萃取時(shí)間和(c)淋洗溶劑、洗脫劑對(duì)TC(0.05 g/L)萃取效率的影響(n=3)Fig. 5 Effects of (a) the pH value of loading solvents(b) extraction time and (c) washing solvents on the extraction efficiencies of TC (0.05 g/L, n=3) The washing solvents and elution solvents in Fig. 5c: 1. methanol-acetic acid (4∶1, v/v); 2. methylbenzene; 3. methanol-methylbenzene (1∶19, v/v); 4. dichloromethane; 5. ethyl acetate; 6. alcohol; 7. tetrahydrofuran; 8. Britton-Robinson buffer solution Ⅱ(0.022 mol/L of phosphoric acid-acetic acid-boric acid and 0.087 mol/L of sodium hydroxide, pH 10.0).

2.3 磁分散固相萃取條件的優(yōu)化

以HMMs為吸附劑,對(duì)磁分散固相萃取的條件(上樣溶液的pH、萃取時(shí)間、淋洗液和洗脫劑)進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化(見(jiàn)圖5)。

2.3.1 上樣溶液的pH對(duì)萃取效率的影響

在25 ℃條件下，以不同pH的B-R緩沖溶液為上樣溶液(TC的質(zhì)量濃度為0.05 g/L),考察pH值對(duì)TC萃取效率的影響。由圖5a可知,以HMMs為吸附劑時(shí),吸附量隨著pH值的增加呈先增大后減小的趨勢(shì),并且在pH=6.00時(shí)吸附量達(dá)到最大。因此實(shí)驗(yàn)選擇pH=6.00的B-R緩沖溶液Ⅰ為上樣溶液。

2.3.2 萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響

考察了在25 ℃、pH=6.00和TC質(zhì)量濃度為0.05 g/L時(shí)萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響。如圖5b所示,萃取時(shí)間為0～30 min時(shí),HMMs對(duì)TC的吸附量隨萃取時(shí)間的增加明顯增大,在30 min時(shí)吸附量達(dá)到最大;繼續(xù)增加萃取時(shí)間,吸附量沒(méi)有明顯變化,即吸附已達(dá)到飽和。因此實(shí)驗(yàn)選擇30 min為實(shí)際樣品的萃取時(shí)間。

2.3.3 淋洗液和洗脫劑對(duì)萃取效率的影響

淋洗液的目的是洗去雜質(zhì),保留目標(biāo)物質(zhì);洗脫劑的目的是將目標(biāo)物質(zhì)洗脫下來(lái)。因此,為了更好的避免樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾同時(shí)將目標(biāo)物質(zhì)更好地洗脫下來(lái)，選擇8種不同極性的溶劑對(duì)HMMs上的TC進(jìn)行解吸附。由圖5c可以看出,當(dāng)選擇二氯甲烷溶液為淋洗溶劑時(shí),TC的回收率最低,因此,選擇二氯甲烷溶液作為淋洗液;當(dāng)B-R緩沖溶液Ⅱ?yàn)榱芟慈軇r(shí),TC的回收率最高,因此實(shí)驗(yàn)選擇B-R緩沖溶液Ⅱ?yàn)橄疵搫?/p>

2.4 吸附劑的重復(fù)性考察

為了研究HMMs的可重復(fù)性,稱取20 mg活化后的HMMs,加入10.0 mL質(zhì)量濃度為0.05 g/L的TC溶液,按1.5節(jié)步驟進(jìn)行磁分散固相萃取。將吸附劑HMMs循環(huán)使用7次,每次3組平行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示:第5次循環(huán)吸附的平均吸附容量為9.61 mg/g,與第一次吸附容量相比,仍能保持在原吸附容量的(93.00±1.00)%;第5～7次間的吸附量相差較少,并趨于穩(wěn)定。通過(guò)循環(huán)試驗(yàn)證明了HMMs吸附劑具有較好的吸附與解吸附性質(zhì),可重復(fù)使用。

圖 6 HMMs的可重復(fù)性(n=3)Fig. 6 Reusability of the HMMs (n=3)

圖 7 (a)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mg/L)、(b)空白蜂蜜樣品和(c)加標(biāo)(100 μg/kg)蜂蜜樣品中四環(huán)素類抗生素的色譜圖 Fig. 7 Chromatograms of the tetracycline antibiotics(TCs) in (a) a mixed standard solution (0.05 mg/L), (b) a black honey sample and (c) a spiked honey sample (100 μg/kg)

2.5 富集與凈化效果的考察

為了研究HMMs的富集與凈化效果,分別對(duì)質(zhì)量濃度為0.05 mg/L的TCs(TC、CTC和DC)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(見(jiàn)圖7a)、空白蜂蜜樣品(見(jiàn)圖7b)和加標(biāo)(100 μg/kg)蜂蜜樣品(見(jiàn)圖7c)進(jìn)行磁分散固相萃取,洗脫液經(jīng)氮吹至近干后用1.0 mL的流動(dòng)相溶解,最后經(jīng)HPLC檢測(cè)。從圖7a可以看出,磁分散固相萃取前,TCs的色譜峰信號(hào)較弱,難以定量;經(jīng)磁分散固相萃取后,目標(biāo)物的色譜峰信號(hào)增強(qiáng);由圖7b和7c可知,經(jīng)磁分散固相萃取處理后，色譜圖不但減少了雜質(zhì)峰的干擾,基線漂移降低,而且富集后目標(biāo)物的色譜峰信號(hào)明顯增強(qiáng)。由此可見(jiàn)，合成的HMMs對(duì)蜂蜜樣品中的TCs有較好的凈化和富集效果。

2.6 線性方程和檢出限

配制系列質(zhì)量濃度為0.02、0.025、0.05、0.10、0.20、0.50和1.00 mg/L的TCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.6節(jié)所述的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè),得到3種物質(zhì)的線性方程(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示,TC、CTC和DC的峰面積(A)與質(zhì)量濃度(C, mg/L)在0.02～1.00 mg/L范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 1～0.999 9。TCs的檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分別為1.92～2.56 μg/kg和6.40～8.53 μg/kg。

2.7 富集因子

富集因子(enrichment factor, EF)可通過(guò)方程式EF=Co/Ci計(jì)算得到,其中，Co(g/L)和Ci(g/L)分別是樣品溶液中分析物的初始質(zhì)量濃度和經(jīng)MDSPE后的質(zhì)量濃度。經(jīng)計(jì)算,TC、CTC和DC的平均富集因子分別為7.59、3.73和4.03(見(jiàn)表2)。

表 2 3種TCs的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和富集因子Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs) and enrichment factors (EFs) of the three TCs

A: peak area;C: mass concentration, mg/L.

2.8 實(shí)際樣品分析

以HMMs為磁性微球，采用MDSPE-HPLC測(cè)定蜂蜜樣品中的TCs,并進(jìn)行了蜂蜜樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)。如表3所示,在0.05、0.10和0.20 mg/kg的加標(biāo)水平下,TC、CTC和DC的回收率為85.8%～94.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～4.4%。結(jié)果表明,制備的HMMs能夠用于食品和生物等復(fù)雜基質(zhì)樣品中TCs的凈化和富集。

表3 加標(biāo)蜂蜜樣品中3種TCs經(jīng)磁分散固相萃取后的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table3 Recoveriesandrelativestandarddeviations(RSDs)ofthethreeTCsspikedinthehoneysamplesaftermagneticdispersionsolidphaseextraction(MDSPE)(n=3) AnalyteSpikedlevel/(mg/kg)Detected/(mg/kg)Recovery/%RSD/%TC0.050.047294.51.70.100.093993.91.90.200.018190.52.5CTC0.050.046993.71.60.100.088288.22.80.200.181290.63.3DC0.050.045791.34.40.100.092192.13.20.200.171685.82.7

3 結(jié)論

本文采用電子轉(zhuǎn)移活化再生催化劑原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法,經(jīng)過(guò)連續(xù)聚合反應(yīng)制備了親水性聚合物刷磁性微球。制備的親水性聚合物刷磁性微球形狀規(guī)則,大小較為均一,并且具有良好的蛋白質(zhì)排阻能力。將制備的親水性聚合物刷磁性微球作為磁分散固相萃取吸附劑用于分離富集蜂蜜中四環(huán)素類抗生素,得到了良好的富集凈化效果。該親水性聚合物刷磁性微球在分離富集和凈化生物樣品、食品樣品和環(huán)境樣品的應(yīng)用中具有較大潛力。

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