不同電針對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬及血清細(xì)胞因子IL－1β、IL－6表達(dá)的影響

莫雨平，鄧曉豐，紀(jì)倩，滕金艷，姚海江，宋洪濤，唐銀杉，許安萍，張淑靜，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

抑郁癥是一種情緒障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為心境低落，軀體不適和睡眠障礙等持久的抑郁狀態(tài)，明顯影響患者日常生活及社會功能。世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測到2020年抑郁癥將成為全球第二大威脅人類健康、增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的疾患［1］。慢性應(yīng)激模型作為一種有效的抑郁模型，已被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的基礎(chǔ)研究和各種治療方法篩選［2］。細(xì)胞因子同神經(jīng)遞質(zhì)和激素一樣，是免疫系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間信息交流的重要信息分子，在維持機體內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)以及參與某些病理狀態(tài)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。它參與機體免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥的調(diào)節(jié)，引起抑郁樣的行為異常:如運動遲緩、睡眠障礙、厭食、體重減輕、痛覺過敏、社會退縮、性欲減低等［3］。為此，本研究擬通過孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)復(fù)制抑郁癥模型并運用電針進(jìn)行干預(yù)，通過免疫組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞因子IL－1β、IL－6在大鼠海馬及血清中的表達(dá)情況，以探討IL－1β、IL－6在大鼠實驗性抑郁癥發(fā)病過程中的作用機制及電針干預(yù)對其影響，為臨床診斷和防治抑郁癥提供新的途徑及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

成年SD大鼠，雄性，60只，體質(zhì)量(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(合格證號:SCXK(京)2012－0001)。溫度(25±2)℃，濕度(50±20)%，自然光照，自由進(jìn)食、進(jìn)水(除實驗要求禁食禁水外)。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，1周后采用開野試驗、糖水試驗及體質(zhì)量測量進(jìn)行行為學(xué)評分，選取得分相近的SD大鼠60只，隨機分為5組，每組12只，正常組6只/籠飼養(yǎng)，正常飲食，不給予任何刺激;模型組1只/籠孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激。

1.2 實驗儀器試劑

Thermo離心機(美國);Thermo酶標(biāo)儀(美國);百憂解(美國禮來公司，20mg，批號J20030017);IL－1β、IL－6抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG及SP試劑盒(北京中山生物科技公司);DAB顯色試劑盒(北京中山生物科技公司);枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);PBS緩沖液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);上海朗頓酶聯(lián)免疫試劑盒。

華佗牌無菌針灸針(0.30×25mm，天津杏林書院醫(yī)療器械有限公司);LH202型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所監(jiān)制，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);ZJ－12H音樂電針治療儀(中國針灸學(xué)會研制，深圳市圣祥高科技有限公司)。

2 方法

2.1 孤養(yǎng)結(jié)合CUMS模型的建立

本實驗采用多種不可預(yù)知的刺激方法交替進(jìn)行，以避免大鼠對單一或有規(guī)律的應(yīng)激刺激產(chǎn)生耐受性，隨機接受21天7種不同的應(yīng)激刺激，平均每種刺激3次。包括禁食(24h)、禁水(24h)、潮濕環(huán)境(24h)、冷水游泳(10℃，5min)、夾尾(距尾尖 2cm，5min)、電擊(100V，2mA，5min)、搖晃(1 次/s，15min)。

2.2 各組干預(yù)方法

步驟參考本課題組前期研究結(jié)果［4－6］。

2.3 開野試驗

敞箱長×寬×高(100cm×100cm×50cm)，內(nèi)側(cè)四周壁及箱底面均為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25方格。操作步驟參考本課題組前期研究結(jié)果［4－6］，但將觀察時間由 3min 延長至5min。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬IL－1β、IL－6表達(dá)情況

具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，一抗抗體濃度 IL －1β(1∶50)、IL －6(1∶100)。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清IL－1β、IL－6表達(dá)量

大鼠于鍘刀快速斷頭，離心管取血，室溫下靜置20min，待血液凝固后4℃低溫高速離心機4000rpm/min離心10min，移液器分離血清至1.5ml的離心管，－80℃冰箱保存，待測。嚴(yán)格按照上海朗頓酶聯(lián)免疫試劑盒操作步驟進(jìn)行大鼠血清IL－1β、IL－6檢測。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠開野實驗結(jié)果比較

如圖1所示，21天應(yīng)激刺激后，與空白組比較，模型組水平運動及垂直運動均明顯減少(P＜0.01)，說明造模成功。與模型組比較，百憂解組與兩個電針組活動度均明顯升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，說明百憂解和兩種電針均有抗抑郁作用。

3.2 各組大鼠血清IL－1β、IL－6表達(dá)情況比較

如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠血清IL－1β、IL－6表達(dá)水平升高(均 P ＜0.01);與模型組比較，百憂解組、電針組(P＜0.05)、音樂電針組IL－1β表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，但三個治療組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。與模型組比較，百憂解組IL－6表達(dá)水平有明顯下調(diào)趨勢(P＜0.01)，電針組與音樂電針組IL－6表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，三個治療組之間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 各組大鼠海馬內(nèi)IL－1β、IL－6表達(dá)情況比較

如圖3所示，與空白組比較，模型組大鼠海馬內(nèi)IL－1β、IL－6表達(dá)水平升高(均 P ＜0.01);與模型組比較，百憂解組(P＜0.05)、電針組、音樂電針組IL－1β表達(dá)水平下調(diào);與百憂解組比較，音樂電針組大鼠海馬內(nèi)IL－1β下調(diào)幅度稍低(P≤0.05)。與模型組比較，百憂解組 IL－6表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(P＜0.05)，電針組與音樂電針組IL－6表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異，三個治療組之間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組大鼠開野實驗水平運動及垂直運動次數(shù)比較(s，n=12)

圖2 各組大鼠血清IL－1β、IL－6表達(dá)情況比較(s，n=6)

4 討論

本實驗采用孤養(yǎng)與CUMS結(jié)合的方法復(fù)制抑郁模型，具有應(yīng)激因子多變及不可預(yù)見的特點，與人類抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機制較為接近。應(yīng)激后模型組大鼠活動減少，探索興趣降低，說明抑郁癥模型復(fù)制成功，經(jīng)典陽性藥百憂解及兩組電針均能逆轉(zhuǎn)此變化，有抗抑郁的作用，可進(jìn)行下一步機制分析。

海馬與學(xué)習(xí)、記憶、行為和情緒關(guān)系密切，也是應(yīng)激損傷的重要靶點［7］。細(xì)胞因子是一類主要由活化免疫細(xì)胞分泌的具有重要生物學(xué)特性的小分子蛋白或多肽，是神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)節(jié)因子［8］。細(xì)胞因子除了介導(dǎo)免疫細(xì)胞互相傳遞信息外，還可能在抑郁癥發(fā)病機制中起重要作用。Owen等［9］發(fā)現(xiàn)，抑郁癥與IL－1β產(chǎn)生增加相關(guān)，并且他認(rèn)為是抑郁導(dǎo)致IL－1β增加，IL－1β是抑郁癥的一個特異性指標(biāo)。因為無論是心因性還是軀體反應(yīng)性抑郁，外周和中樞的IL－1β增加和炎癥反應(yīng)系統(tǒng)的激活，都可引起抑郁癥狀或抑郁癥。Maes等［10］認(rèn)為，各種免疫反應(yīng)和急性期反應(yīng)的基礎(chǔ)是單核細(xì)胞分泌IL－6的增加，同時還可導(dǎo)致HPA軸活動過度及5－HT代謝障礙，進(jìn)而出現(xiàn)疾病癥狀(如嗜睡、乏力、食欲減退、抑郁等)和植物神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如出汗、心慌等)。Kagaya等［11］研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血漿中的 IL－1β、IL－6濃度均顯著高于正常健康人;蔡巍等［12］研究報道，抑郁癥患者血清中IL－1β、IL－6水平較正常健康人要明顯升高，經(jīng)過治療后，隨著患者癥狀的改善，相應(yīng)的細(xì)胞因子水平也下降，進(jìn)一步說明細(xì)胞因子的激活可能是抑郁癥發(fā)病原因之一［13－15］。

圖3 各組大鼠海馬內(nèi)IL－1β、IL－6表達(dá)情況比較(s，n=6)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，抑郁癥發(fā)病的病機是臟氣受損，髓海虧虛，神機紊亂。印堂、百會為督脈之穴，督脈行于身后，循脊入腦，其布在身，其用在神，其本在腦，本著“經(jīng)脈所過，主治所及”，選取督脈治療與腦相關(guān)的神志病符合中醫(yī)治病必求其本之說。此外，印堂穴具有調(diào)神醒腦的功效，百會穴為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰肝經(jīng)交會之穴，選取該兩穴來治療抑郁癥，可以調(diào)節(jié)其髓海機能，增進(jìn)其“五臟化氣”的生理功能，使其紊亂的神機恢復(fù)正常，以達(dá)到抗抑郁的效果［4－6］。

電針療法是在我國傳統(tǒng)針灸治療基礎(chǔ)上發(fā)展而來，脈沖電針儀發(fā)出周期性重復(fù)的波形，用以加強針感，具有針刺和電場的雙重作用，但在治療后期因機體對其適應(yīng)而出現(xiàn)效果衰減，這一直是困擾電針的一大難題［16－17］。為了徹底擺脫脈沖電針的弱點，更好地提高電針服務(wù)臨床的療效，波型參差不齊但均和諧的音樂電針儀應(yīng)運而生，音樂電針就是將電針治療與音樂治療兩者合而為一的方法，克服了機體耐受這一缺點［16－17］。另外，音樂也具有鎮(zhèn)靜、安神、舒緩情緒的作用?！秲?nèi)經(jīng)》中說“五臟之象，可以類推，五臟相音，可以意識”。古人在長期的實踐及體驗中，發(fā)現(xiàn)音樂與臟氣之間有共鳴、互動的關(guān)系，不同調(diào)式的音樂分別影響著人體相應(yīng)的臟腑。音樂電針的處方即是運用了中醫(yī)陰陽五行學(xué)說，以五音應(yīng)五臟及“五音療疾”的原理創(chuàng)作而成，便于辨證施“樂”［4－6］。

本實驗結(jié)果顯示，兩種電針療法在改善抑郁模型大鼠行為學(xué)方面與百憂解療效一致，說明電針治療抑郁模型大鼠效果不輸于經(jīng)典抗抑郁藥物;抑郁大鼠血清及海馬內(nèi)IL－1β、IL－6的含量高于正常組，兩組電針組與百憂解組均能下調(diào)IL－1β、IL－6的含量，改善模型大鼠抑郁狀態(tài)，但兩組電針組無統(tǒng)計學(xué)差異。分析原因如下:大鼠與人相比，屬低級動物，音樂電針的音樂治療對其效果不突出，只是頻率和波形較普通脈沖電針有所區(qū)別，僅僅克服了普通脈沖電針容易造成患者耐受或穴位不敏感這一缺點，音樂治療的優(yōu)勢并未充分體現(xiàn)。若將實驗設(shè)計于臨床展開，音樂電針的治療作用可能會更加突顯。作為危害人類身心健康的高發(fā)病率、常見病種之一的抑郁癥，病程長，易復(fù)發(fā)等是其特點，目前主要以藥物治療或控制為主。但臨床常用的抗抑郁藥物抗抑郁譜窄，毒副作用大。而電針治療抑郁癥是立足于整體調(diào)節(jié)，副作用低，可以作為治療抑郁癥的方法逐漸應(yīng)用臨床。

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