冠心病合并2型糖尿病發(fā)病與CCL21基因rs2812377多態(tài)相關(guān)性研究

程茗慧, 劉 丹, 宋海旭, 閆承慧, 張效林

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院寒地心血管病全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016

冠心病是動(dòng)脈血管壁慢性炎癥反應(yīng)性疾?。?］,炎性因子可以誘發(fā)糖類和脂質(zhì)成分的積聚沉積在動(dòng)脈粥樣硬化的血管壁,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂,進(jìn)一步導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓的形成。糖尿病是冠心病患者的主要致病因素之一。有研究報(bào)道,冠心病合并2型糖尿病的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì),因而,在臨床上對(duì)冠心病合并2型糖尿病的防治十分重要［2-3］。冠心病合并2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚,有研究發(fā)現(xiàn),冠心病合并2型糖尿病作為一種復(fù)雜的代謝性疾病,冠狀動(dòng)脈血管壁的慢性炎癥反應(yīng)在此過程中發(fā)揮著重要的作用［4］。趨化因子CCL21通過募集血液中單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入病變區(qū)域參與機(jī)體免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)性疾病。趨化因子受體7(chemokine receptor 7,CCR7)是趨化因子CCL21的一個(gè)受體分子［5］。Damas等［6］研究發(fā)現(xiàn),冠心病患者中趨化因子CCL21表達(dá)水平較正常對(duì)照者明顯增高。同時(shí),Luchtefeld等［7］發(fā)現(xiàn),CCL21-/-LDL-/-小鼠Western diet喂養(yǎng)16周后,CCL21的表達(dá)缺失可以減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。CCL21作為一種趨化因子為CCR7受體的配體,在發(fā)揮趨化因子引起冠狀動(dòng)脈血管壁炎癥反應(yīng)的同時(shí),激活CCR7受體引起動(dòng)脈粥樣硬化血管壁的免疫炎性反應(yīng)［8-10］。本研究旨在探討冠心病合并2型糖尿病的發(fā)病與CCL21基因rs2812377多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率的改變是否存在相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步分析CCL21基因rs2812377多態(tài)與冠心病合并2型糖尿病患者血漿中CCL21表達(dá)水平是否相關(guān)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2009年3月至2011年9月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的225例冠心病合并2型糖尿病患者為研究對(duì)象,并設(shè)為冠心病合并2型糖尿病組。納入標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖≥7.0 mmol/L,或者餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L;均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查。同時(shí),納入因胸痛入院但冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)其冠狀動(dòng)脈主支無狹窄且不滿足糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的95例患者設(shè)為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均知情并簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 對(duì)入選的冠心病合并2型糖尿病患者及正常對(duì)照人群,由專門從事本項(xiàng)目研究的科研工作人員詢問病史。同時(shí),收集兩組研究對(duì)象的血漿生化指標(biāo)及心肌酶學(xué)的情況。

1.2.2 樣本的采集 兩組研究對(duì)象均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血,搖勻,儲(chǔ)存在-20℃冰箱,用封口膜封閉保存。

1.2.3 血漿中CCL21濃度的檢測(cè) 按照美國RD公司生產(chǎn)的CCL21酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒說明書建立趨化因子CCL21檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。CCL21血漿濃度的檢測(cè)采用96孔上樣板,經(jīng)過上樣、孵育、反復(fù)沖洗、顯色后,在酶標(biāo)儀上檢測(cè)待測(cè)定的冠心病合并2型糖尿病患者及正常對(duì)照人群血漿中的CCL21的表達(dá)。

1.2.4 DNA提取 將凍存的靜脈血室溫放置后,加入到15 ml尖頭離心管中,離心10 min(3 000 r/min);裂解紅細(xì)胞;加入10% SDS 0.5 ml,10 mg/ml蛋白酶K 50 μl,37℃、18～20 h。引物設(shè)計(jì)和合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。利用美國BIO-RAD公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀對(duì)CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增工作,整個(gè)擴(kuò)增體系為50 μl,其中,包含冠心病合并2型糖尿病患者225例及正常對(duì)照樣品95例基因組的DNA,同時(shí),在擴(kuò)增體系內(nèi)加入dNTP、聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液、上下游引物和rTaq酶。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng),待反應(yīng)結(jié)束后,將待檢測(cè)樣品取出送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定。

1.3 Mass array技術(shù)分析CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)基因型的頻率 應(yīng)用Mass array飛行質(zhì)譜分析儀對(duì)CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)3個(gè)基因型TT/GT/GG特點(diǎn)進(jìn)行分析驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象一般資料比較 兩組研究對(duì)象的性別比例、高血壓比例、吸煙比例、體質(zhì)量指數(shù),以及總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料比較

2.2 CCL21 rs2812377多態(tài)基因型及等位基因分布頻率比較 趨化因子基因 CCL21 rs2812377多態(tài)位點(diǎn)存在TT型、GT型和GG型3種基因型。兩組研究對(duì)象的趨化因子基因CCL21 rs2812377多態(tài)位點(diǎn)TT型、GT型和GG型3種基因型頻率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［P<0.05,OR=1.62(95%可信區(qū)間1.14～2.29)］。見表2。正常對(duì)照組T等位基因、G等位基因的分布頻率分別為44.21%(84/190)、55.79%(106/190);冠心病合并2型糖尿病組T等位基因、G等位基因的分布頻率分別為33.78%(152/450)、66.22%(298/450)。兩組T等位基因、G等位基因的分布頻率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 CCL21 rs2812377多態(tài)基因型分布頻率比較/例(百分率/%)

2.3 冠心病合并2型糖尿病患者血漿中CCL21表達(dá)水平與rs58801單核苷酸多態(tài)關(guān)聯(lián)分析 分別收集35例冠心病合并2型糖尿病患者及20例正常對(duì)照組研究對(duì)象的血漿標(biāo)本,其中,冠心病合并2型糖尿病患者CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)TT+GT和GG位點(diǎn)的入選樣本例數(shù)分別為18例、17例,正常對(duì)照組分別為11例、9例。冠心病合并2型糖尿病組血漿中CCL21水平為(844.73±146.82)pg/ml,高于正常對(duì)照組的(507.77±103.62)pg/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。冠心病合并2型糖尿病組血漿中TT+GT基因型攜帶者血漿CCL21水平為(800.31±120.21)pg/ml,低于GG型基因型攜帶者的(925.79±129.90)pg/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常對(duì)照組TT+GT基因型及GG基因型攜帶者血漿CCL21水平分別為(517.81±134.25)pg/ml、(495.50±63.31)pg/ml,兩種基因型比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

冠心病發(fā)病受遺傳、環(huán)境等危險(xiǎn)因素的影響,血漿血糖水平升高也是冠心病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一,糖代謝產(chǎn)生異常是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的重要原因［3-4］,降低冠心病合并2型糖尿病患者不良心血管事件的發(fā)生率對(duì)于心血管疾病的防治十分重要［5-6］。

冠心病合并糖尿病患者的動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁慢性炎癥反應(yīng)性疾病,同時(shí)合并血液中血糖水平的增高及胰島素抵抗的一種代謝性疾病。作為一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病,血液循環(huán)中的單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞從血液循環(huán)向受損的血管壁募集是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［7］。免疫系統(tǒng)激活的炎癥反應(yīng)在冠心病發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用,CCL21能夠趨化血液循環(huán)中的單核細(xì)胞移行進(jìn)入動(dòng)脈血管壁,引起動(dòng)脈血管壁慢性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致血液循環(huán)中的脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈血管壁,造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展和不穩(wěn)定斑塊的形成［8-10］。趨化因子CCL21通過與其受體CCR7結(jié)合后,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的激活,并引起機(jī)體免疫耐受反應(yīng)的發(fā)生。有研究報(bào)道,給與CCL21-/-/ApoE-/-雙基因敲除的小鼠Western diet喂養(yǎng)后,小鼠的動(dòng)脈粥樣斑塊面積明顯減少,同時(shí)出現(xiàn)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)功能紊亂的現(xiàn)象［11-15］。因此,對(duì)趨化因子CCL21與其受體CCR7的研究對(duì)冠心病合并2型糖尿病的免疫治療具有重要的臨床意義。

目前,關(guān)于趨化因子CCL21基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病相關(guān)關(guān)系的研究報(bào)道較少見。本研究對(duì)CCL21基因rs2812377基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行病例-對(duì)照研究,結(jié)果顯示,CCL21基因rs2812377不同基因型攜帶者血漿中CCL21表達(dá)水平在冠心病合并2型糖尿病患者中表達(dá)明顯上調(diào)。進(jìn)一步分析CCL21基因rs2812377多態(tài)位點(diǎn)等位基因的頻率分布特點(diǎn)顯示,T等位基因在冠心病合并2型糖尿病人群的分布頻率為33.78%,低于對(duì)照人群的44.21%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分(P<0.05);而G等位基因在冠心病合并2型糖尿病的分布頻率為66.22%,高于對(duì)照人群的55.79%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明,CCL21基因 rs2812377多肽位點(diǎn)G等位基因與冠心病合并2型糖尿病的發(fā)生存在相關(guān)關(guān)系,可能是冠心病合并2型糖尿病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

本研究存在的局限性:本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CCL21基因rs2812377多態(tài)位點(diǎn)與冠心病的發(fā)病存在相關(guān)關(guān)系,應(yīng)該在急性心肌梗死患者中進(jìn)一步印證CCL21基因rs2812377多態(tài)位點(diǎn)是否與急性心肌梗死的發(fā)病存在相關(guān)關(guān)系。同時(shí),未來需要在體實(shí)驗(yàn)對(duì)CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)G/T等位基因進(jìn)行突變分析,分別觀察G等位基因和T等位基因的突變對(duì)冠心病合并2型糖尿病的模型鼠的發(fā)病是否存在相關(guān)關(guān)系。

綜上所述,趨化因子CCL21表達(dá)水平在冠心病合并2型糖尿病患者血漿中明顯上調(diào),CCL21基因rs2812377多肽位點(diǎn)G等位基因可能是冠心病合并2型糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素。