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    黃芪藥渣中多糖的酶法制備及其抗氧化活性

    2018-03-05 08:52:05龍良鯤寒子純林群英秦秀雯趙浩源丁少軍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:藥渣酶法線蟲

    龍良鯤,寒子純,林群英,秦秀雯,趙浩源,丁少軍

    (1.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,江蘇南京 210037;2.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042)

    黃芪屬豆科植物,分為蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]和膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.],以干燥根入藥[1]。黃芪的主要藥用成分為黃芪多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃酮等[2]。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides,APS)可作為免疫增強(qiáng)劑或調(diào)節(jié)劑,促進(jìn)抗體形成,同時還有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激、抗氧化和降脂等功效[3-5]。工業(yè)上多采用水提醇沉法提取黃芪多糖,其工藝簡單易操作,但提取率較低(在3.80%~9.78%之間)[6-8]。黃芪經(jīng)水提法制備多糖后形成的藥渣中仍含有多糖等活性物質(zhì),這些物質(zhì)被纖維素等聚合物限制而不易溶出[9-10]。纖維素酶是可降解纖維素高聚物的一組酶系,在制備多糖等藥用活性物質(zhì)方面具有良好的應(yīng)用前景[8,11]。本試驗利用纖維素酶制備黃芪藥渣中的多糖,通過單因素和正交試驗優(yōu)化酶解作用條件,并評價黃芪多糖的抗氧化活性,為進(jìn)一步高效利用黃芪資源提供技術(shù)途徑。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    黃芪,產(chǎn)地為甘肅省隴西縣,購自安徽省亳州市中藥材市場;里氏木霉(Trichodermareesei)D-86271,購自芬蘭VTT技術(shù)中心;秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans),由筆者所在實驗室保存。百草枯,購自Sigma公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

    PDA培養(yǎng)基:200 g馬鈴薯,20 g葡萄糖,15 g瓊脂粉,加蒸餾水至1 000 mL。

    Mandels培養(yǎng)基:2.0 g KH2PO4,1.4 g(NH4)2SO4,0.3 g Urea,0.3 g MgSO4·7H2O,1.0 mL微量元素濃縮液(3.7 g/L CoCl2·6H2O,1.4 g/L ZnSO4·7H2O,1.6 g/L MnSO4·H2O,5.0 g/L FeSO4·7H2O),10.0 g葡萄糖,0.3 g 酵母膏,加蒸餾水至1 000 mL。

    固體發(fā)酵培養(yǎng)基:1.5 g小麥麩,1.5 g脫木素麥稈,5.0 mL 10×Mandels培養(yǎng)基。具體配制方法參考文獻(xiàn)[12]。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶 參照文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶。取約108個里氏木霉孢子(PDA平板培養(yǎng)獲得)接種于100 mL Mandels培養(yǎng)基,并于28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d。將1 mL菌絲培養(yǎng)物接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,混勻后30 ℃培養(yǎng)13 d。發(fā)酵結(jié)束后,每瓶發(fā)酵物中加入30 mL無菌水(含0.1%吐溫80),置于25 ℃、120 r/min 條件下提取120 min。提取液經(jīng)8 000 r/min、10 min 離心后取上清液。所得粗酶液加入終濃度為0.02%的三氮化鈉,并置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 酶活性的測定 參照文獻(xiàn)[12]中的方法分別測定發(fā)酵液中濾紙酶、內(nèi)切型纖維素酶(CMC酶活)、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的活性。酶活性測定均在50 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH值為4.8)中進(jìn)行,各設(shè)3個重復(fù)。1個單位(U)濾紙酶、CMC酶或木聚糖酶分別定義為1 min催化相應(yīng)底物生成1 μmol葡萄糖(濾紙酶和CMC酶)或木糖(木聚糖酶)的酶量;1個單位(U)的β-葡萄糖苷酶定義為1 min催化4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)生成1 μmol 4-硝基苯酚的酶量。

    1.2.3 黃芪藥渣的獲得 黃芪經(jīng)粉碎后,按固液質(zhì)量比為 1 ∶10 加入蒸餾水,90 ℃、150 r/min水浴浸提2 h,5 000 r/min 離心10 min獲得上清液,重復(fù)提取1次。所得上清液加3倍體積的99%乙醇溶液,充分混勻,4 ℃靜置過夜,6 000 r/min、10 min離心,沉淀經(jīng)60 ℃烘干,即得黃芪粗多糖。所得黃芪殘渣烘干至恒質(zhì)量,裝袋密封備用。

    1.2.4 酶法提取黃芪藥渣中的多糖

    1.2.4.1 單因素試驗 稱取1 g黃芪藥渣裝入50 mL離心管中,加入5 mL 0.05 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH值為4.8),分別加入不同量(0~10 U)的纖維素酶(以濾紙酶活性計算),加入無菌水使總體積為10 mL。經(jīng)50 ℃酶解2 h后,反應(yīng)物經(jīng)80 ℃水浴提取4 h,離心法獲得上清液并經(jīng)醇沉法獲得粗多糖。粗多糖經(jīng)適當(dāng)稀釋后,以苯酚-硫酸比色法測定總糖含量,并以二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測定寡糖含量,兩者之差即為多糖含量[13]。同時,比較不同酶解溫度(35~55 ℃)或酶解時間(1~8 h)對酶法制備黃芪多糖的影響。

    1.2.4.2 正交優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,對纖維素酶用量、酶解時間和酶解溫度進(jìn)行正交設(shè)計(表1),優(yōu)化黃芪多糖提取的最佳酶解條件。

    表1 L16(43)正交試驗設(shè)計表

    1.2.5 黃芪多糖的抗氧化活性

    1.2.5.1 DPPH自由基清除測定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行DPPH自由基清除測定,分別配制不同濃度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/mL)的黃芪多糖。向10 mL玻璃試管中依次加入1 mL各濃度黃芪多糖待測液和2 mL 0.6 mg/L DPPH,混勻,室溫避光反應(yīng)30 min,測定517 nm處的吸光度。以50%乙醇作為空白對照,每個處理重復(fù)3次,求平均值。DPPH清除率的計算公式如下:

    SCDPPH=(1-DS517 nm/DC517 nm)×100%。

    式中:SCDPPH為DPPH的清除率;DS517 nm為樣品的吸光度;DC517 nm為對照的吸光度。

    1.2.5.2 線蟲抗氧化測定 通過添加百草枯誘導(dǎo)秀麗線蟲產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷以評價黃芪多糖的抗氧化活性。將黃芪多糖制成一定濃度的溶液后,添加至培養(yǎng)有秀麗線蟲的96孔板中,于20 ℃培養(yǎng)48 h,再于每個孔里添加百草枯,使其終濃度為40 mmol/L。每24 h觀察1次線蟲存活情況并記錄線蟲存活數(shù)目,直至秀麗線蟲全部死亡,每組試驗所測秀麗線蟲數(shù)目不少于80條。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 纖維素酶的制備及酶活性測定

    由圖1可知,粗酶液中的濾紙酶、β-葡萄糖苷酶、CMC酶和木聚糖酶的活性分別為2.02、1.99、167.00、53.90 U/mL??梢?,固態(tài)發(fā)酵液中含有較高水平的纖維素酶和半纖維素酶。

    2.2 酶法制備黃芪藥渣中多糖的影響因素

    2.2.1 纖維素酶用量對黃芪多糖提取的影響 由圖2可知,未經(jīng)纖維素酶水解作用,從黃芪藥渣中水提獲得的多糖提取量為2.9 mg/g;纖維素酶用量為0.2 U/g時,多糖提取量達(dá)8.2 mg/g。增加纖維素酶的用量,多糖的提取量明顯升高,纖維素酶用量為4.0 U/g時,多糖提取量達(dá)到最大值,為 34.7 mg/g。繼續(xù)增加纖維素酶的用量,黃芪多糖的提取量無明顯變化。因此,提取黃芪多糖的最佳纖維素酶用量為 4.0 U/g。酶解處理獲得的多糖量最高可達(dá)未經(jīng)纖維素酶處理組的11.97倍。

    2.2.2 酶解溫度對黃芪多糖提取的影響 酶解溫度對酶法制備黃芪多糖的效率有明顯的影響。由圖3可知,低溫(35 ℃)下,酶法提取黃芪多糖的提取量為27.9 mg/g。提高酶解溫度,黃芪多糖的提取量明顯增加,在45 ℃時,黃芪多糖的提取量達(dá)到最大值,為35.7 mg/g。繼續(xù)升高溫度,黃芪多糖的提取量明顯降低。因此,利用纖維素酶提取黃芪藥渣中黃芪多糖的最適溫度為45 ℃。

    2.2.3 酶解時間對黃芪多糖提取的影響 由圖4可知,隨著酶解時間的延長,黃芪多糖的提取量明顯升高。酶解時間為4 h時,黃芪多糖的提取量達(dá)34.6 mg/g。進(jìn)一步延長酶解時間,多糖提取量呈現(xiàn)下降的趨勢。因此,酶解4 h為最佳的酶解時間。

    2.3 正交優(yōu)化試驗

    根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,繼續(xù)對纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時間這3個因素進(jìn)行正交設(shè)計優(yōu)化以獲得最佳的提取條件。正交試驗結(jié)果如表2所示,各因素對黃芪多糖提取量的影響程度表現(xiàn)為酶解溫度>纖維素酶用量>酶解時間。根據(jù)試驗結(jié)果優(yōu)化得最佳提取條件為酶解溫度45 ℃、纖維素酶用量 4.0 U/g、 酶解時間4 h。最后經(jīng)驗證,在此條件下黃芪多糖的提取量為44.6 mg/g。

    表2 酶法提取黃芪多糖的正交試驗結(jié)果

    2.4 黃芪多糖的抗氧化活性

    由圖5可知,隨著黃芪多糖濃度的升高,其對DPPH自由基的清除率明顯提高,當(dāng)黃芪多糖濃度達(dá)到0.30 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率可達(dá)25.4%。繼續(xù)升高黃芪多糖的濃度,其對DPPH自由基的清除率則無明顯增加。

    由圖6可知,0.30 mg/mL黃芪多糖能夠明顯提高線蟲的存活率,最長存活時間為9 d,比空白對照組(CK)延長4 d。由圖7可知,添加0.30 mg/mL黃芪多糖,秀麗線蟲的平均壽命為3.48 d,比對照組(2.67 d)提高了30.3%。因此,黃芪多糖明顯降低了百草枯對線蟲引起的氧化損傷,其具有良好的抗氧化作用。

    3 結(jié)論與討論

    水提醇沉工藝只能獲取黃芪組織中部分多糖,殘留的藥渣中仍含有豐富的多糖等活性物質(zhì)[9],這部分物質(zhì)由于受組織中纖維素等結(jié)構(gòu)成分的限制而難以溶出。微生物等來源的纖維素酶能夠有效作用于黃芪組織中的纖維結(jié)構(gòu),從而促進(jìn)黃芪多糖的提取[8,11,15]。相對于堿法(如氧化鈣水溶液)制備黃芪多糖,酶法制備具有條件溫和、產(chǎn)物純度高和綠色環(huán)保等優(yōu)勢。本試驗以里氏木霉固態(tài)發(fā)酵獲得了高活性的纖維素酶,以經(jīng)2次高溫水提處理的黃芪藥渣作為材料提取多糖。結(jié)果顯示,與未經(jīng)酶處理的對照組相比,酶解處理使黃芪多糖的提取量提高了11.97倍。正交優(yōu)化試驗結(jié)果表明,酶法制備多糖中的主要影響因素影響由大到小依次為酶解溫度、纖維素酶用量、酶解時間,而最佳酶解參數(shù)為酶解溫度45 ℃、纖維素酶用量 4.0 U/g、酶解時間 4 h,在此條件下,從黃芪藥渣中可獲得 44.6 mg/g 黃芪多糖。由此可見,纖維素酶對促進(jìn)黃芪藥渣中多糖的制備具有重要的意義。同時,是否存在更加有效的黃芪組織水解酶系以進(jìn)一步提高黃芪多糖的提取效率值得進(jìn)一步研究。

    抗氧化活性是黃芪多糖的重要生理功能[16]。本試驗體外抗氧化試驗結(jié)果表明,酶法制備的黃芪多糖對DPPH自由基的清除率為25.4%,低于文獻(xiàn)報道值[14,17]。這可能與獲得的黃芪多糖分子量或結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系[18]。同時,以秀麗線蟲為模型測試黃芪多糖的體內(nèi)抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)0.30 mg/mL黃芪多糖明顯增強(qiáng)了秀麗線蟲對百草枯的抗性,處理組線蟲的平均壽命延長了30.3%。結(jié)果表明,纖維素酶法制備的黃芪多糖具有結(jié)構(gòu)完整性,顯示出良好的抗氧化活性。利用纖維素酶技術(shù)促進(jìn)黃芪藥渣中多糖的制備,對實現(xiàn)黃芪資源的高效利用具有重要意義。

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