寡糖誘導(dǎo)桔梗抗根腐病的研究

李堆淑

(商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000)

桔梗[Platycodongrandiflorus(Jacp.)A.DC.]為桔?？?Campanulaceae)多年生草本植物，在我國主要分布于東北、華北、華中、華南等地區(qū)。其根可入藥，是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有較高的食用價(jià)值[1]。近年來，由于大片種植桔梗，管理粗放，桔梗的根腐病、枯萎病、根結(jié)線蟲病、紫紋羽病、斑枯病、白粉病等病害越來越嚴(yán)重，直接影響了桔梗的生長發(fā)育，還影響了桔梗入藥的品質(zhì)和質(zhì)量。桔梗根腐病發(fā)病比較頻繁，根腐病是由半知菌類鐮刀菌引起的根部病害，是一種土傳病害，土壤濕度大或作物連作易發(fā)病，比較難防治。利用誘抗劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性來防治病害，在許多植物上均有較好的防治效果[2]。植物的誘導(dǎo)抗病性作為一種后天免疫功能可以降低植物的受害程度[3]。局部抗性伴隨著植保素的積累、細(xì)胞壁的加強(qiáng)[4]，而系統(tǒng)抗性的獲得以病程相關(guān)蛋白作為重要生化標(biāo)記。寡糖(oligosaccharide)是經(jīng)酸水解、堿水解或酶水解而制得2～10個(gè)單糖分子組成的低聚合度水溶性的糖類。寡糖可以促進(jìn)植物生長和發(fā)育，誘導(dǎo)激活植物體內(nèi)合成抗性相關(guān)酶及增加基因表達(dá)量，促使植保素合成、木質(zhì)素積累，提高植物的抗病能力[5]。因此，本研究用腐皮鐮刀菌酸水解的寡糖誘導(dǎo)已感病的桔梗苗，研究桔?？垢?腐皮鐮刀菌)的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桔梗苗高20 cm左右，盆栽；腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)，由商洛學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，18 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水。

馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，1 000 mL 蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 寡糖的制備 先將腐皮鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，然后將直徑為5 mm的菌餅接入PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，放在搖床(25 ℃、130 r/min)上培養(yǎng)5 d。分成2份，一份將菌絲體用蒸餾水洗3次，低溫烘干、粉碎過100目篩，稱取10 g菌絲粉，用1.0 mol/L HCl酸解1 h，調(diào)節(jié)pH值為7；再加入90%乙醇，進(jìn)行分級(jí)沉淀，4 000 r/min離心15 min得到淺棕色的多糖粉末；配制成濃度分別為0、5、10、15、20 μg/mL的寡糖溶液，備用。另一份配成109CFU/mL孢子懸浮液，備用。

1.2.2 桔梗苗的處理 將桔梗苗浸泡于腐皮鐮刀菌的孢子懸浮液(109CFU/mL)3 d后，水培養(yǎng)桔梗苗10 d，再用不同濃度的寡糖溶液對(duì)桔梗苗的葉面進(jìn)行噴施(噴至溶液不流為止)，以噴施蒸餾水作為對(duì)照(CK)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每天噴1次，連續(xù)處理3 d后分為2份，一份從第3天開始每天采樣1次，到第8天，測(cè)定其生理生化指標(biāo)；另一份分別在第0、第3、第6、第8天觀察并統(tǒng)計(jì)桔梗苗根腐病的病情指數(shù)和防治效果，每次調(diào)查15株。

1.2.3 病情調(diào)查 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為桔梗苗根部未發(fā)病，1級(jí)為病斑面積占根部總面積的5%及以下，3級(jí)為病斑面積占根部總面積的6%～10%，5級(jí)為病斑面積占根部總面積的11%～25%，7級(jí)為病斑面積占根部總面積的26%～50%，9級(jí)為病斑面積占根部總面積的51%及以上(葉片枯萎或葉柄折斷)[6]。

病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)病根數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總根數(shù)×最高級(jí)代表值)；

防治效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.4 桔梗生理生化指標(biāo)測(cè)定 過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，測(cè)定470 nm處的吸光度，以1 min吸光度的變化值表示酶活力[7]。過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法[8]。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用四氮唑藍(lán)光還原法，測(cè)定560 nm處的吸光度[9]。丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，分別測(cè)定600、532、450 nm處的吸光度[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔梗苗的病情指數(shù)調(diào)查

由表1可知，不同濃度的寡糖溶液對(duì)桔梗苗抗根腐病的誘導(dǎo)效果不同。在同一時(shí)間，隨著寡糖溶液濃度的增大，桔梗苗根腐病的病情指數(shù)不斷減小，當(dāng)寡糖溶液的濃度增加到 10 μg/mL 時(shí)，桔梗苗根腐病的病情指數(shù)最小，再增大寡糖溶液的濃度，桔梗苗根腐病的病情指數(shù)逐漸增大。隨著寡糖溶液誘導(dǎo)桔梗苗時(shí)間的延長，只有10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)的防治效果一直增大，其余處理濃度誘導(dǎo)的防治效果均是先增大后減小。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，CK處理的桔梗苗根腐病的病情指數(shù)逐漸升高，且高于寡糖溶液處理的病情指數(shù)。當(dāng)寡糖溶液濃度為10 μg/mL時(shí)，防治桔梗苗根腐病的效果最好，且在第8天桔梗苗根腐病的防治效果為36.36%，分別比5、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)的防治效果高217.83%、61.24%、525.82%。

表1 桔梗苗根腐病的病情指數(shù)及防治效果

2.2 寡糖溶液對(duì)桔梗苗葉片生理特征的影響

2.2.1 寡糖溶液對(duì)桔梗苗葉片SOD活性的影響 由圖1可知，經(jīng)不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理3 d桔梗苗，桔梗苗葉片SOD活性均有所變化。在第3天至第8天用不同濃度的寡糖溶液和CK誘導(dǎo)處理桔梗苗葉片，其SOD活性均先升高后降低，桔梗苗葉片的SOD活性表現(xiàn)為10 μg/mL寡糖溶液 >15 μg/mL寡糖溶液>5 μg/mL寡糖溶液>20 μg/mL寡糖溶液>CK，且均在第7天達(dá)到最大值。用10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片的SOD活性最大值分別比15、5、20 μg/mL 寡糖溶液及CK誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片SOD活性最大值高14.21%、16.35%、19.63%、27.92%?？梢?，10 μg/mL 寡糖溶液誘導(dǎo)桔梗苗抗根腐病的能力最佳，且明顯高于其他濃度寡糖溶液的誘導(dǎo)效果，表明低濃度的寡糖溶液更能有效誘導(dǎo)桔梗苗提高葉片的SOD活性，增強(qiáng)桔梗苗的抗病能力。

2.2.2 寡糖溶液對(duì)桔梗苗葉片POD活性的影響 POD作為生物體一種重要的氧化還原酶，能促進(jìn)殺菌效果及木質(zhì)素和木栓質(zhì)的合成，從而殺滅病原菌或阻止病原物質(zhì)入侵，POD活性與抗病性密切相關(guān)[11]。由圖2可知，桔梗苗經(jīng)不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理后，桔梗苗葉片POD活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，其中，CK處理的桔梗苗葉片POD活性總是明顯低于寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片的POD活性。5、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片POD活性的升降幅度均較穩(wěn)定，10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片POD活性的升降幅度較大。10 μg/mL寡糖溶液在誘導(dǎo)處理第5天時(shí)，桔梗苗葉片的POD活性達(dá)到峰值，且明顯高于其他處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值。5、10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值均出現(xiàn)在第5天，CK和15 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)處理的第6天，20 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片POD活性的峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)處理的第7天，要增強(qiáng)桔梗葉片抗根腐病的能力，必須通過提高POD的活性才能抵抗病害帶來的影響?？梢姡?0 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗葉片POD活性最大，表明一定濃度的寡糖對(duì)桔?？垢〉恼T導(dǎo)有一定的效果。

2.2.3 寡糖溶液對(duì)桔梗苗葉片CAT活性的影響 CAT作為一種誘導(dǎo)酶，可以催化木質(zhì)素的形成，促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化來抵抗病原菌的侵染[11]。由圖3可知，經(jīng)不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗葉片CAT活性均發(fā)生了變化。CK處理的桔梗苗葉片CAT活性一直降低，5、10、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片CAT活性均先升高后降低，在誘導(dǎo)處理第5天時(shí)，桔梗苗葉片CAT活性均達(dá)到峰值，10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理從第4天至第8天桔梗苗葉片的CAT活性明顯高于其他3種濃度處理的桔梗苗葉片的CAT活性。5、10、15 μg/mL 寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片CAT活性較明顯，20 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片CAT活性的變化較平緩。10 μg/mL 寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片CAT活性的峰值分別比CK、5、15、20 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗葉片CAT活性的峰值高153.20%、20.12%、22.44%、137.08%?？梢姡欢舛鹊墓烟侨芤赫T導(dǎo)處理桔梗苗，其葉片的CAT活性增強(qiáng)，可抵御病原菌的侵害，且 10 μg/mL 寡糖溶液誘導(dǎo)處理的效果最明顯，說明10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)桔梗苗抗根腐病的效果最佳。

2.2.4 寡糖溶液對(duì)桔梗苗葉片MDA含量的影響 由圖4可知，用不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理桔梗苗，其葉片MDA的含量均有不同程度的變化。在第3天至第8天，CK處理的桔梗葉片MDA含量一直上升，說明隨著時(shí)間的延長腐皮鐮刀菌不斷地入侵桔梗細(xì)胞。用不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理桔梗苗，其葉片的MDA含量變化趨勢(shì)總體上是先下降后上升，5、10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)處理的桔梗苗，其葉片MDA含量變化較明顯，均在誘導(dǎo)處理的第6天達(dá)到最低值，且在整個(gè)誘導(dǎo)過程中10 μg/mL寡糖溶液處理的桔梗葉片MDA含量比其他處理的桔梗苗葉片MDA含量低。可見，一定濃度的寡糖溶液能夠有效降低桔梗苗葉片中MDA的含量，從而降低了對(duì)植物膜質(zhì)的傷害程度。表明10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)桔梗苗抗根腐病有較好的效果。

2.3 寡糖溶液對(duì)桔梗苗葉片各生理指標(biāo)相關(guān)性的影響

由表2可知，經(jīng)不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理已感根腐病的桔梗苗，從第3天至第8天桔梗苗葉片的POD、CAT、SOD活性與MDA的含量均兩兩相關(guān)。POD活性與CAT、SOD活性在0.001水平上顯著正相關(guān)，CAT活性與MAD含量在0.001水平上顯著負(fù)相關(guān)，CAT活性與SOD活性在0.05水平上顯著正相關(guān)，MDA含量與POD、SOD活性在0.01水平上顯著負(fù)相關(guān)。

表2 桔梗苗葉片各生理指標(biāo)的相關(guān)性

注：“*”“**”“***”分別表示在0.05、0.01、0.001水平上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

植物可以改變細(xì)胞代謝和激發(fā)不同的防御機(jī)制來調(diào)節(jié)外界的各種脅迫。利用植物誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)水稻、煙草、蔬菜等植物的抗病性[12-14]。寡糖作為植物誘導(dǎo)劑，具有環(huán)保、安全、穩(wěn)定等特點(diǎn)，寡糖可以參與植物的抗病、抗逆反應(yīng)，它能夠快速誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化并激活抗病基因的表達(dá)，降低脂質(zhì)過氧化物水平，減輕植物的傷害。

本研究用不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)處理已經(jīng)感染根腐病3 d的桔梗苗，在同一時(shí)間，隨著寡糖溶液濃度的增加，桔梗苗根腐病的病情指數(shù)不斷減小，當(dāng)寡糖溶液的濃度增加到 10 μg/mL 時(shí)，桔梗苗根腐病的病情指數(shù)最小，再增加寡糖溶液的濃度，桔梗苗根腐病的病情指數(shù)逐漸增大。隨著處理時(shí)間的延長，經(jīng)10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)的防治效果一直增大，其他濃度的寡糖溶液處理，桔梗苗根腐病的防治效果先增大后減小。經(jīng)10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)的桔梗苗的防治效果最好，且在第8天桔梗苗根腐病的防治效果為36.36%。不同濃度的寡糖溶液誘導(dǎo)桔梗苗葉片，與CK相比，均能提高桔梗苗葉片SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，降低桔梗苗葉片細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，且10 μg/mL寡糖溶液誘導(dǎo)的效果最佳。桔梗苗葉片的POD、CAT、SOD活性均兩兩呈顯著正相關(guān)，MAD含量分別與POD、CAT、SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān)。譚姣姣等的研究表明，0.5% 南極菌β-3胞外寡聚糖能夠顯著降低黃瓜白粉病的病情指數(shù)，防治效果達(dá)24.49%，能提高黃瓜幼苗POD的活性[15]。用不同濃度的堆肥菌液誘導(dǎo)處理的桔梗幼苗，其SOD活性、POD活性、葉綠素含量與CK相比均有明顯的升高，而MDA含量則有明顯的下降趨勢(shì)[16]。孫翠紅等的研究表明，殼寡糖對(duì)煙草花葉病毒的抑制率為66.39%，還可以提高煙草葉片中SOD、POD、CAT、PAL的活性[17]。本研究的結(jié)果與這3個(gè)研究的結(jié)果基本一致。

[1]賀學(xué)禮.植物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2008.

[2]李堆淑，胡景江.低聚殼聚糖誘導(dǎo)大葉黃楊抗白粉病的組織病理學(xué)機(jī)制[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24(5)：106-109.

[3]趙繼紅，孫淑君，李建中.植物誘導(dǎo)抗病性與誘抗劑研究進(jìn)展[J].植物保護(hù)，2003，29(4)：7-10.

[4]李 金，臧 威，孫劍秋，等.植物誘導(dǎo)抗病性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(18)：7745-7746，7755.

[5]張付云，趙小明，白雪芳，等.殼寡糖誘導(dǎo)植物抗病性研究進(jìn)展[J].中國生物防治，2008，24(2)：174-178.

[6]王 雅，田 芳，譚小艷，等.枯草芽孢桿菌菌株Bv10對(duì)大葉黃楊白粉病的防治效果[J].南陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，12(3)：26-27，40.

[7]錢玉梅，高貴珍，張興桃，等.3種酢漿草過氧化物酶的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(23)：6102-6104.

[8]張志良，瞿偉菁，李小方.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2009.

[9]Stewart R R，Bewley J D.Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes[J].Plant Physiology，1980，65(2)：245-248.

[10]高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2006：210.

[11]程小龍.外源水楊酸誘導(dǎo)煙草抗青枯病的作用及機(jī)理研究[D].重慶：西南大學(xué)，2014.

[12]朱振元.寡糖激發(fā)子的化學(xué)合成及誘導(dǎo)煙草對(duì)黑脛病抗性的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2003.

[13]白春微，蔣選利.幾種誘導(dǎo)因子對(duì)水稻紋枯病的誘導(dǎo)抗病性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(11)：116-118.

[14]狄文偉.殼寡糖在蔬菜生產(chǎn)上的應(yīng)用[J].北方園藝，2016(8)：54-55.

[15]譚姣姣，李 江，何培青.南極菌β-3胞外寡聚糖對(duì)黃瓜的誘導(dǎo)抗病作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(30)：16903-16905.

[16]李堆淑.生活垃圾堆肥菌劑誘導(dǎo)桔梗抗腐皮鐮刀菌研究[J].商洛學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，30(6)：58-62.

[17]孫翠紅，徐翠蓮，趙銘欽，等.殼寡糖及其衍生物抗煙草花葉病毒機(jī)理的初步研究[J].中國煙草科學(xué)，2015，36(2)：87-92.