潛在促生菌株的篩選及其在小麥上的應用效果

劉拴成，張翠英，何月秋

(1.云南農業(yè)大學植物保護學院，云南昆明 650201；2.集寧師范學院生物系，內蒙古烏蘭察布 012000；3.北京師范大學烏蘭察布集寧附屬中學，內蒙古烏蘭察布 012000)

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)的研究和應用已成為當前微生物研究的新熱點之一。目前，一般將微生物肥料分為兩大類，即狹義的(根瘤菌肥)和廣義的(通過產(chǎn)生植物激素、抗生素等促進植物營養(yǎng)吸收的肥料)。內生細菌是指能夠定殖在植物細胞間隙或細胞內，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關系的一類微生物[1]，目前已在大量的非豆科農作物根際發(fā)現(xiàn)固氮菌，如丁延芹等從小麥、玉米和黑麥草的根際土壤中分離出固氮芽孢桿菌[2]。因此，農民們更愿意花更低廉的價格去購買那些對人類健康和環(huán)境有益的新型微生物肥料[3]?，F(xiàn)在有些人傾向于育種工作，如經(jīng)過遺傳工程改造，將來會提高種子的抗病性，但即使是應用遺傳工程改造得到了優(yōu)良的品種，所需的時間卻是相當長的，而且所耗費的人力、物力、財力是相當大的，此外育出的新品種向市場推廣還需要一定的時間[4]。而PGPR肥料的使用既對環(huán)境無污染，又對人的身體無害，同時價格低廉，很快適應了當代消費者的需求。在可持續(xù)的、生態(tài)的農業(yè)系統(tǒng)中，有機農業(yè)是避免或拒絕大量合成的化學肥料、殺蟲劑、生長調節(jié)劑、動物飼料添加劑的一類產(chǎn)業(yè)化系統(tǒng)[5]。為了推動有機農業(yè)系統(tǒng)的可行性實施，我們主要依靠生物肥料、作物輪作、秸稈還田、廄肥、綠肥，以及遠離農場的有機廢氣物、機械化耕作、生物病蟲害防治等確保土壤生產(chǎn)力，特別是適量的微生物肥料與常規(guī)化肥混合使用不僅表現(xiàn)為增產(chǎn)，還可養(yǎng)地。PGPR不僅通過供給植物營養(yǎng)來促進植物生長，也可以幫助保護清潔的環(huán)境和土壤生產(chǎn)力，是化學合成肥料很好的替代品。生物肥料通過共生或非共生固氮作用增加土壤中的氮元素含量。據(jù)統(tǒng)計，全球約有1 750萬t氮元素是通過生物固氮來增加土壤中的氮元素含量的。高檔磷肥昂貴而且緊缺，但是生物肥料能夠彌補這個缺口，有多種微生物能夠溶解來源比較廉價的磷元素，如磷酸鹽。還有某些PGPR能促進植物與有益根際真菌之間的共生[6-8]，這正是當前農資市場上所必需的肥料，并且從經(jīng)濟、環(huán)境效益來看也符合農民的要求，比如增加農民收入、減少肥料的費用、減少溫室氣體的排放和減少硝態(tài)氮向地下水的排放[9]，這正是PGPR所具有的特點。微生物肥料正成為新興“綠色產(chǎn)業(yè)”，在農業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮其應有的經(jīng)濟價值、社會價值和生態(tài)價值。例如，對玉米施用“肥力高”復合菌肥，可以使抽雄期、吐絲期、開花期和成熟期均比對照提早2 d，且能促進玉米生長，改善穗粒結構，提早成熟，提高產(chǎn)量，增加效益，同時對土壤也有一定的改良作用[10]。施用生物肥能增強玉米根系活力，提高葉片內的硝酸還原酶活力及葉綠素的含量，促進玉米生長，提高其產(chǎn)量，使其籽粒品質也得到改善[11-13]。同時，生物肥料還可以改善土壤的理化性狀，提高土壤肥力。目前，全世界的農藥和化學肥料使用量在增長，造成了有機肥使用不足，土壤養(yǎng)分比例失調，土地板結，土壤質量下降，河流、地下水污染等一系列問題[14]。適當降低化肥用量并配合施用生物肥料(拌種或追施)，可以在不增加(甚至減少)肥料投入的情況下提高小麥、玉米等糧食作物的產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟效益[15]。因此，從植物根際篩選這類內生細菌意義重大，將篩選出的菌株初步應用在小麥試驗上，可為將來開發(fā)這種微生物肥料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用小麥材料為川麥107，種子購自當?shù)厥袌?；大腸桿菌DH5α，筆者所在實驗室保存；主要試劑有胰蛋白胨、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、氯化鈣、硝酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、植酸鈣、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三氯乙酸(TCA)、氨芐青霉素(Amp)等，均為分析純，購自永華化學科技(江蘇)有限公司。

1.2 潛在促生菌株的篩選

采用土壤平板稀釋法，從不同植物根際土壤中篩選具有植酸酶活性的生防菌株，將稀釋后的細菌菌液涂布于LB平板上(含10 g胰蛋白胨、5 g蛋白胨、10 g氯化鈉、12 g瓊脂、1 L 蒸餾水，pH值=7)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落轉接到含有植酸鈣的篩選平板上(含2%葡萄糖、0.2%氯化鈣、0.5% 硝酸銨、0.05%氯化鉀、0.05%硫酸鎂、0.001%硫酸亞鐵、0.001%硫酸錳、0.1%植酸鈣、1.5%瓊脂，pH值=7)，于30 ℃培養(yǎng)3 d，挑選產(chǎn)生透明消解圈的菌株，從中挑選出透明消解圈最大的菌株對指示植物進行促生長效果研究。

1.3 促生菌植酸酶基因的克隆

1.3.1 潛在促生菌株總DNA的提取 采用CTAB法提取微量基因組DNA，具體步驟如下：(1)活化保存的菌種，挑取單菌落至含LB液體培養(yǎng)基的20 mL小管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。(2)取1.5 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，用蒸餾水洗滌1～2次。(3)在沉淀物管中加入565 μL TE緩沖液，用移液槍反復吹打使之懸浮。加入2 μL 50 mg/mL溶菌酶溶液(終濃度100 μg/mL)，37 ℃保溫20 min。(4)加入10 μL RNase(10 mg/mL)，至終濃度為 25 μg/mL，然后加入30 μL 10% SDS溶液，37 ℃保溫30 min。(5)加入2.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，至終濃度為50 μg/mL，37 ℃保溫60～90 min。(6)加入100 μL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80 μL CTAB-NaCl溶液(含50 g/L CTAB、0.5 mol/L NaCl)，混勻，于65 ℃保溫 10 min。(7)加入等體積24 ∶1的三氯甲烷、異戊醇，混勻，離心5 min，將上清液轉入1支新的離心管中，如果難以移出上清液，先用牙簽除去界面物質。(8)加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻直至DNA沉淀下來，再分別用70%、95%的乙醇洗滌1次。(9)12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，在超凈工作臺上風干，重溶于100 μL TE溶液中，4 ℃保存。

1.3.2 植酸酶基因部分片段的克隆

1.3.2.1 植酸酶基因引物的設計及反應體系 利用已合成的植酸酶引物，以從不同農作物根系周圍分離到的CY12、CY18、CY20、CY48菌株基因組DNA為模板進行擴增。PCR反應體系如表1所示，反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增反應在Eppendorf Mastercycler Gradient型PCR儀上進行。

表1 PCR反應體系

1.3.2.2 感受態(tài)細胞的制備、連接及轉化 將筆者所在實驗室保存的大腸桿菌DH5α活化后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min反應10～12 h，再從此瓶中取 1 mL 培養(yǎng)液，接種于另一個裝有9 mL LB液體培養(yǎng)基的 25 mL 細胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)約2 h后，進行感受態(tài)細胞制作。具體步驟如下：(1)取上述培養(yǎng)好的DH5α于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，冰浴30 min。(2)將(1)中的培養(yǎng)物于 6 000 r/min 離心2 min，沉淀用1 mL 0.1 mol/L的CaCl2洗滌2次。(3)6 000 r/min離心2 min，將沉淀再用適量0.1 mol/L CaCl2懸浮，4 ℃放置，待用。制備好感受態(tài)細胞后，緊接著進行連接、轉化，步驟如下：(1)連接。將PCR產(chǎn)物再經(jīng)過膠回收植酸酶基因片斷，根據(jù)以下體系進行連接：3 μL純化后的PCR產(chǎn)物，0.5 μL pUCm-T[含有氨芐抗性(Ampr)]，1 μL 10× Ligation Buffer，1 μL PEG 4000，4 μL滅菌ddH2O，0.5 μL T4DNA連接酶，混勻后于22 ℃連接過夜。(2)轉化。①取 100 μL 已制備好的感受態(tài)細胞置于冰上，待完全溶解后，輕輕混勻。②將已擴增出的目標片段與載體連接過夜。③加入5 μL連接液，輕輕混勻，冰上放置30 min。④42 ℃水浴熱激約90 s，冰上放置2 min。⑤加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1～2 h后，用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(含100 mg/L Amp)進行紅白反應斑反應篩選轉化子。麥康凱培養(yǎng)基配方：取10 g麥康凱瓊脂，加入200 mL蒸餾水，101 ℃ 滅菌 30 min。⑥選取白斑，接種于500 μL LB液體培養(yǎng)基(含100 mg/L Amp)。

1.3.2.3 植酸酶基因測序 將擴增出的963 bp特異性片段用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收，回收過程按照生工生物工程(上海)股份有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒的步驟進行，并克隆至載體pUCm-T上，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證。

1.4 植酸酶基因的序列分析

將得到的序列通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLAST比對找出與已公布的植酸酶基因序列同源性較高的一系列序列，通過生物學軟件DNAMAN 5.2.10.1、TreeView X 0.5.0進行核酸序列分析。

1.5 植酸酶活性測定步驟

1.5.1 磷標準曲線的繪制 將4.0 mmol/L磷酸二氫鉀標準溶液用Tris-HCl(0.1 mol/L，pH值=7)分別稀釋成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L的溶液，按照植酸酶活性測定步驟同時反應。以無機磷含量為縱坐標(取0.2 mL以上稀釋液，無機磷含量分別為0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μmol)，以D600 nm為橫坐標，繪制標準曲線，列出直線回歸方程(y=kx+b)。

植酸酶活性定義：樣品在植酸鈉濃度為5 mmol/L、溫度為37 ℃、pH值=7的條件下，1 min內從植酸鈉(Sigma，P-8810)中釋放1 μmol無機磷，即為1個植酸酶活性單位，以A表示。植酸酶活性A計算公式如下：

A=K[D600 nm(樣品)-D600 nm(空白)]/30。

式中：A為樣品植酸酶活性；K為標準曲線斜率；30為反應時間(min)。

1.5.2 植酸酶活性測定 挑取單菌落于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，培養(yǎng)過夜，按接種量10%接種于裝有200 mL ASW(含5 g MgCl2·6H2O、5 g MgSO4·7H2O、500 mg KCl、500 mg CaCl2、20 g NaCl、3 g胰蛋白胨、1.5 g大豆蛋白胨、5 g葡萄糖)液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、170 r/min，連續(xù)5 d，每隔12 h取樣1次。

該產(chǎn)酶培養(yǎng)基參照ldriss等的方法[16]并稍作修改，植酸酶活性測定參照Choi等方法[17]并稍作修改，具體步驟見表2。

表2 植酸酶活性測定步驟

注：表中各個處理的總體積均為3.0 mL。

1.6 小麥促生長試驗

1.6.1 室內拌種促生長試驗 用滅菌水將CY18分別稀釋為B200、B500、B1 000處理，濃度分別為2.5×108、1.0×108、5.0×107CFU/mL，另設清水對照(CK)，取上述不同濃度菌液各10 mL，分別放入已標記好的培養(yǎng)皿中，再將表面消過毒的小麥品種川麥107分別放入培養(yǎng)皿中拌種10 min，晾干后，將種子放入裝有土的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿20粒種子，各個處理3次重復，共8個處理。以后根據(jù)土壤干濕狀況澆清水，以保持土壤濕潤，室內培養(yǎng)。5 d后調查小麥植株生長狀況，分別測定其鮮質量、株高、根長，記錄試驗結果。

1.6.2 小區(qū)浸種促生長試驗 參照“1.6.1”節(jié)，用滅菌水將CY18分別稀釋為B200、B500、B1 000處理，另設清水對照(CK)，將已消毒的小麥品種川麥107種子于上述不同濃度菌液中浸種1 h后晾干，立即播種于事先劃分好的田間小區(qū)內。每個重復播50粒種子。各個處理3次重復，共8個處理。18 d后調查小麥植株生長狀況，分別測定其鮮質量、株高、根長。

2 結果與分析

2.1 潛在促生菌株的篩選及植酸酶基因編碼區(qū)的擴增

經(jīng)過解磷菌篩選培養(yǎng)基篩選，從晉寧、屏邊、玉溪、元江等地的作物根圍共篩選出4株具有解磷作用的菌株，即CY12、CY18、CY20、CY48。通過設計特異引物，對其進行特異性PCR電泳檢測結果表明，這4個菌株均擴增出1個 963 bp 的特異性條帶(圖1)，與預期條帶大小一致。然后選出解磷效果最好的(即透明消解圈最大的)菌株CY18(圖2)，經(jīng)革蘭氏染色、芽孢染色，初步確定該菌株為芽孢桿菌，并對其進行促生長試驗。

2.2 CY18菌株植酸酶基因序列分析

將得到的序列通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST比對，找出與已公布的植酸酶基因序列同源性較高的一系列序列，通過生物學軟件DNAMAN5.2.10.1、TreeView X 0.5.0進行核酸序列分析。通過BLAST比對，CY18菌株與已經(jīng)在GenBank中登錄的13條植酸酶基因核苷酸序列的平均同源性高達97%，同源性范圍為91.5%～99.7%(表3)。遺傳距離范圍為0.003～0.085(表4)，遺傳距離最近的為EU624118。從系統(tǒng)進化樹和同源樹來看，按進化中親緣關系的遠近明顯分為兩大進化源，其中AF453255與AY836773、AF029053、AJ277890為第一大進化源，其余的為第二大進化源，CY18屬于第2大進化源(圖3、圖4)。

2.3 不同培養(yǎng)時間植酸酶活性的變化

2.3.1 磷標準曲線的制作 根據(jù)“1.5.1”節(jié)的步驟，對6個梯度的磷酸二氫鉀標準溶液，按植酸酶活性測定步驟，以無機磷含量為縱坐標(0.2 mL稀釋液中的無機磷含量分別為0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μmol)、以D600 nm為橫坐標繪制標準曲線(圖5)。

2.3.2 CY18菌株不同時間植酸酶活性變化 由圖6可知，CY18菌株植酸酶活性在前36 h變化緩慢，后來較快上升，72 h 時的酶活性為0.012 5 U，再以后緩慢上升直到108 h時活性達到最高值，為0.013 6 U，此后活性又極速下降。

2.4 拌種、浸種處理對小麥促生長效果

就拌種而言，不同處理對小麥發(fā)育前期各生物學指標有不同程度的影響(表5)。B200、B500、B1 000處理與對照相比在鮮質量、株高、根長上作用效果整體趨勢一致，都表現(xiàn)出高濃度抑制、低濃度促生的效應，中濃度促生效果最好。B500處理與對照相比，鮮質量、株高、根長分別增加5.56%、22.87%、52.25%，差異達到極顯著水平(除鮮質量外)。

表3 14條芽孢桿菌植酸酶基因核苷酸序列同源性比較結果 %

表4 14條芽孢桿菌植酸酶基因核苷酸序列距離

就浸種而言，不同濃度梯度浸種小麥對生育前期各個指標影響各異，由圖7可以看出，效果比較好的是B1 000處理，與對照相比在株高、鮮質量上分別增加16.43%、34.18%，但以上處理對根長均無明顯影響。

表5 CY18菌液拌種在室內對小麥鮮質量、株高和根長的影響

注：表中數(shù)據(jù)均為“均值±標準誤”。同列數(shù)據(jù)后標有不同小寫、大寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

3 討論

3.1 PGPR對植物的促生效應

植物根圍、根際細菌促進植物生長的重要性眾所周知[18-19]。de Freitas等報道，假單胞菌能夠刺激小麥的生長[20]。當豌豆、大豆的種子用根圍細菌浸泡后，其根莖的生長和營養(yǎng)物質的吸收量都會增加[21-22]。H?flich等報道，通過根圍密切相關的細菌促進植物生長的機制更可能是由于營養(yǎng)物質的流動、植物激素的產(chǎn)生、對土傳植物病原物的拮抗形成的[19，23]。根圍細菌棲居在有機質相對豐富的根表，并合成植物生長素，可作為一種次生代謝產(chǎn)物促進植物的生長。植物激素對植物的生長調節(jié)發(fā)揮著非常重要的作用，它們可以促進種子萌發(fā)、根的延長、增加葉面積[24]。Patten等研究表明，產(chǎn)植物激素是一個細菌促進植物生長的重要因素，它們在低濃度下，通過改變生理學和形態(tài)學過程來調控植物生長。前人已經(jīng)在假單胞菌屬中的多個種中發(fā)現(xiàn)它們可以合成IAA，從而影響根的生長[25]。國內外利用微生物促進植物生長成功的例子很多，但大多數(shù)集中于假單胞菌、芽孢桿菌屬中，微生物肥料雖然在近10年逐步受到重視，但仍處于摸索發(fā)展階段，目前，增加農作物的產(chǎn)量主要依靠化學肥料，施用化學肥料雖然見效快，但是由于長期大量施用同類化學肥料，不僅對環(huán)境造成嚴重的污染，而且給人畜的健康也帶來了威脅，造成大量有毒的化學成分累積，如重金屬中毒等。因此，有必要大力提倡推廣微生物的應用，篩選能有效促進植物生長的生物資源。

本研究表明，從根圍分離出來的細菌也能夠顯著促進小麥的生長，應用于促生長的菌株CY18可能的促生機制是一種激素，也表現(xiàn)出高濃度抑制，低濃度效果不明顯，只有在適合的濃度才能發(fā)揮更好的作用，另一個可能的機制就是菌株產(chǎn)生植酸酶，能更有效地吸收中等肥力土壤中的磷元素，從而促進植物的生長。據(jù)報道，土壤中僅有0.1%的總磷可被植物利用[26-27]，大部分以植酸或植酸鹽的形式貯存起來。在本研究中，應用的菌株可以擴增出植酸酶基因的部分編碼區(qū)，所以猜測這也是促生長的一個機制，但是該菌株只表現(xiàn)出表觀的促生效應，沒有對其主要病害進行調查。因此，對于病害的發(fā)生與前期生物學指標的關系就不是很清楚，是否由于控制了病害而間接地促進植物生長，還有待后人進一步研究。由于時間有限，筆者只是對該菌株應用于低磷條件下對農作物的促生效果進行初步研究，至于在什么樣的磷肥水平下菌株的解磷效果最好且促生效果最佳，還需后人進一步研究。

3.2 對菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化及對菌株進行遺傳改良的必要性

細菌的生長繁殖依賴于從周圍環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質[28-29]。因此，培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分的比例是否適合細菌的生長，以及是否適合活性物質的產(chǎn)生，會在很大程度上影響目標產(chǎn)物的產(chǎn)量[30]。實踐表明，培養(yǎng)基的配方不僅是決定活性物質產(chǎn)量的關鍵因素，其營養(yǎng)成分的比例也決定活性物質的種類，除培養(yǎng)基影響外，菌株的代謝活性與培養(yǎng)條件密切相關，尤其受溫度、接種量影響較大[31]。因此，在確立促生作用的主要機制后，必須針對目標方向摸索不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、接種量、轉速等影響因素的最優(yōu)組合，力求使目標產(chǎn)物最大化。此外，選擇適當?shù)陌l(fā)酵時間，使目標產(chǎn)物達到最高且穩(wěn)定，這樣有利于分離、提純活性物質。如果條件允許，針對具體菌株的具體情況，探索不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、接種量、轉速等條件的最佳組合，將會大大提高目標活性物質的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。除優(yōu)化培養(yǎng)基條件、發(fā)酵條件外，利用物理或化學方法對菌株進行誘變，或利用現(xiàn)代基因工程技術對菌株進行遺傳改良，均是提高目標活性物質產(chǎn)量的有效途徑。關于細菌菌株的誘變改良，前人已做過大量試驗，并在不少菌株上取得了成功，盧文軒等采用低能氮離子束注入技術成功對硅酸鹽細菌進行誘變，經(jīng)過初篩、復篩選出解鉀能力強的硅酸鹽細菌S-05，發(fā)酵液50倍稀釋處理組速效鉀含量最高，分別比原菌株處理組(CK1)、空白對照組(CK2)提高55.79%、260.84%[32]。趙志浩等通過紫外線、硫酸二乙酯交替處理篩選出1株產(chǎn)菌量和芽孢生成量較高的突變株PE-R，其產(chǎn)量約是原菌株的2倍[33]。對熒光假單胞桿菌進行物理或化學誘變改良或進行基因改造，以提高其抗病能力、增強適應性，近些年來已有越來越多的研究報道。

4 結論

通過土壤平板稀釋法，從玉米根圍分離到1株解磷作用較強的芽孢桿菌CY18。CY18浸種、拌種對小麥等有明顯的促生長效應，在濃度不同時，促生長效應明顯不同：中濃度效果最佳，低濃度和高濃度效果不太理想。

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