潛在促生菌株的篩選及其在小麥上的應(yīng)用效果

劉拴成，張翠英，何月秋

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.集寧師范學(xué)院生物系，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；3.北京師范大學(xué)烏蘭察布集寧附屬中學(xué)，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000)

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)的研究和應(yīng)用已成為當(dāng)前微生物研究的新熱點(diǎn)之一。目前，一般將微生物肥料分為兩大類，即狹義的(根瘤菌肥)和廣義的(通過產(chǎn)生植物激素、抗生素等促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收的肥料)。內(nèi)生細(xì)菌是指能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物[1]，目前已在大量的非豆科農(nóng)作物根際發(fā)現(xiàn)固氮菌，如丁延芹等從小麥、玉米和黑麥草的根際土壤中分離出固氮芽孢桿菌[2]。因此，農(nóng)民們更愿意花更低廉的價格去購買那些對人類健康和環(huán)境有益的新型微生物肥料[3]?，F(xiàn)在有些人傾向于育種工作，如經(jīng)過遺傳工程改造，將來會提高種子的抗病性，但即使是應(yīng)用遺傳工程改造得到了優(yōu)良的品種，所需的時間卻是相當(dāng)長的，而且所耗費(fèi)的人力、物力、財力是相當(dāng)大的，此外育出的新品種向市場推廣還需要一定的時間[4]。而PGPR肥料的使用既對環(huán)境無污染，又對人的身體無害，同時價格低廉，很快適應(yīng)了當(dāng)代消費(fèi)者的需求。在可持續(xù)的、生態(tài)的農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，有機(jī)農(nóng)業(yè)是避免或拒絕大量合成的化學(xué)肥料、殺蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、動物飼料添加劑的一類產(chǎn)業(yè)化系統(tǒng)[5]。為了推動有機(jī)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的可行性實(shí)施，我們主要依靠生物肥料、作物輪作、秸稈還田、廄肥、綠肥，以及遠(yuǎn)離農(nóng)場的有機(jī)廢氣物、機(jī)械化耕作、生物病蟲害防治等確保土壤生產(chǎn)力，特別是適量的微生物肥料與常規(guī)化肥混合使用不僅表現(xiàn)為增產(chǎn)，還可養(yǎng)地。PGPR不僅通過供給植物營養(yǎng)來促進(jìn)植物生長，也可以幫助保護(hù)清潔的環(huán)境和土壤生產(chǎn)力，是化學(xué)合成肥料很好的替代品。生物肥料通過共生或非共生固氮作用增加土壤中的氮元素含量。據(jù)統(tǒng)計，全球約有1 750萬t氮元素是通過生物固氮來增加土壤中的氮元素含量的。高檔磷肥昂貴而且緊缺，但是生物肥料能夠彌補(bǔ)這個缺口，有多種微生物能夠溶解來源比較廉價的磷元素，如磷酸鹽。還有某些PGPR能促進(jìn)植物與有益根際真菌之間的共生[6-8]，這正是當(dāng)前農(nóng)資市場上所必需的肥料，并且從經(jīng)濟(jì)、環(huán)境效益來看也符合農(nóng)民的要求，比如增加農(nóng)民收入、減少肥料的費(fèi)用、減少溫室氣體的排放和減少硝態(tài)氮向地下水的排放[9]，這正是PGPR所具有的特點(diǎn)。微生物肥料正成為新興“綠色產(chǎn)業(yè)”，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮其應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價值、社會價值和生態(tài)價值。例如，對玉米施用“肥力高”復(fù)合菌肥，可以使抽雄期、吐絲期、開花期和成熟期均比對照提早2 d，且能促進(jìn)玉米生長，改善穗粒結(jié)構(gòu)，提早成熟，提高產(chǎn)量，增加效益，同時對土壤也有一定的改良作用[10]。施用生物肥能增強(qiáng)玉米根系活力，提高葉片內(nèi)的硝酸還原酶活力及葉綠素的含量，促進(jìn)玉米生長，提高其產(chǎn)量，使其籽粒品質(zhì)也得到改善[11-13]。同時，生物肥料還可以改善土壤的理化性狀，提高土壤肥力。目前，全世界的農(nóng)藥和化學(xué)肥料使用量在增長，造成了有機(jī)肥使用不足，土壤養(yǎng)分比例失調(diào)，土地板結(jié)，土壤質(zhì)量下降，河流、地下水污染等一系列問題[14]。適當(dāng)降低化肥用量并配合施用生物肥料(拌種或追施)，可以在不增加(甚至減少)肥料投入的情況下提高小麥、玉米等糧食作物的產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益[15]。因此，從植物根際篩選這類內(nèi)生細(xì)菌意義重大，將篩選出的菌株初步應(yīng)用在小麥試驗(yàn)上，可為將來開發(fā)這種微生物肥料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用小麥材料為川麥107，種子購自當(dāng)?shù)厥袌?；大腸桿菌DH5α，筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；主要試劑有胰蛋白胨、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、氯化鈣、硝酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、植酸鈣、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三氯乙酸(TCA)、氨芐青霉素(Amp)等，均為分析純，購自永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司。

1.2 潛在促生菌株的篩選

采用土壤平板稀釋法，從不同植物根際土壤中篩選具有植酸酶活性的生防菌株，將稀釋后的細(xì)菌菌液涂布于LB平板上(含10 g胰蛋白胨、5 g蛋白胨、10 g氯化鈉、12 g瓊脂、1 L 蒸餾水，pH值=7)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到含有植酸鈣的篩選平板上(含2%葡萄糖、0.2%氯化鈣、0.5% 硝酸銨、0.05%氯化鉀、0.05%硫酸鎂、0.001%硫酸亞鐵、0.001%硫酸錳、0.1%植酸鈣、1.5%瓊脂，pH值=7)，于30 ℃培養(yǎng)3 d，挑選產(chǎn)生透明消解圈的菌株，從中挑選出透明消解圈最大的菌株對指示植物進(jìn)行促生長效果研究。

1.3 促生菌植酸酶基因的克隆

1.3.1 潛在促生菌株總DNA的提取 采用CTAB法提取微量基因組DNA，具體步驟如下：(1)活化保存的菌種，挑取單菌落至含LB液體培養(yǎng)基的20 mL小管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。(2)取1.5 mL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，用蒸餾水洗滌1～2次。(3)在沉淀物管中加入565 μL TE緩沖液，用移液槍反復(fù)吹打使之懸浮。加入2 μL 50 mg/mL溶菌酶溶液(終濃度100 μg/mL)，37 ℃保溫20 min。(4)加入10 μL RNase(10 mg/mL)，至終濃度為 25 μg/mL，然后加入30 μL 10% SDS溶液，37 ℃保溫30 min。(5)加入2.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，至終濃度為50 μg/mL，37 ℃保溫60～90 min。(6)加入100 μL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80 μL CTAB-NaCl溶液(含50 g/L CTAB、0.5 mol/L NaCl)，混勻，于65 ℃保溫 10 min。(7)加入等體積24 ∶1的三氯甲烷、異戊醇，混勻，離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入1支新的離心管中，如果難以移出上清液，先用牙簽除去界面物質(zhì)。(8)加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻直至DNA沉淀下來，再分別用70%、95%的乙醇洗滌1次。(9)12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，在超凈工作臺上風(fēng)干，重溶于100 μL TE溶液中，4 ℃保存。

1.3.2 植酸酶基因部分片段的克隆

1.3.2.1 植酸酶基因引物的設(shè)計及反應(yīng)體系 利用已合成的植酸酶引物，以從不同農(nóng)作物根系周圍分離到的CY12、CY18、CY20、CY48菌株基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如表1所示，反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler Gradient型PCR儀上進(jìn)行。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.3.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接及轉(zhuǎn)化 將筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌DH5α活化后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min反應(yīng)10～12 h，再從此瓶中取 1 mL 培養(yǎng)液，接種于另一個裝有9 mL LB液體培養(yǎng)基的 25 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)約2 h后，進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞制作。具體步驟如下：(1)取上述培養(yǎng)好的DH5α于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，冰浴30 min。(2)將(1)中的培養(yǎng)物于 6 000 r/min 離心2 min，沉淀用1 mL 0.1 mol/L的CaCl2洗滌2次。(3)6 000 r/min離心2 min，將沉淀再用適量0.1 mol/L CaCl2懸浮，4 ℃放置，待用。制備好感受態(tài)細(xì)胞后，緊接著進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，步驟如下：(1)連接。將PCR產(chǎn)物再經(jīng)過膠回收植酸酶基因片斷，根據(jù)以下體系進(jìn)行連接：3 μL純化后的PCR產(chǎn)物，0.5 μL pUCm-T[含有氨芐抗性(Ampr)]，1 μL 10× Ligation Buffer，1 μL PEG 4000，4 μL滅菌ddH2O，0.5 μL T4DNA連接酶，混勻后于22 ℃連接過夜。(2)轉(zhuǎn)化。①取 100 μL 已制備好的感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待完全溶解后，輕輕混勻。②將已擴(kuò)增出的目標(biāo)片段與載體連接過夜。③加入5 μL連接液，輕輕混勻，冰上放置30 min。④42 ℃水浴熱激約90 s，冰上放置2 min。⑤加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1～2 h后，用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(含100 mg/L Amp)進(jìn)行紅白反應(yīng)斑反應(yīng)篩選轉(zhuǎn)化子。麥康凱培養(yǎng)基配方：取10 g麥康凱瓊脂，加入200 mL蒸餾水，101 ℃ 滅菌 30 min。⑥選取白斑，接種于500 μL LB液體培養(yǎng)基(含100 mg/L Amp)。

1.3.2.3 植酸酶基因測序 將擴(kuò)增出的963 bp特異性片段用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收，回收過程按照生工生物工程(上海)股份有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒的步驟進(jìn)行，并克隆至載體pUCm-T上，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.4 植酸酶基因的序列分析

將得到的序列通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLAST比對找出與已公布的植酸酶基因序列同源性較高的一系列序列，通過生物學(xué)軟件DNAMAN 5.2.10.1、TreeView X 0.5.0進(jìn)行核酸序列分析。

1.5 植酸酶活性測定步驟

1.5.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將4.0 mmol/L磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液用Tris-HCl(0.1 mol/L，pH值=7)分別稀釋成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mmol/L的溶液，按照植酸酶活性測定步驟同時反應(yīng)。以無機(jī)磷含量為縱坐標(biāo)(取0.2 mL以上稀釋液，無機(jī)磷含量分別為0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μmol)，以D600 nm為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列出直線回歸方程(y=kx+b)。

植酸酶活性定義：樣品在植酸鈉濃度為5 mmol/L、溫度為37 ℃、pH值=7的條件下，1 min內(nèi)從植酸鈉(Sigma，P-8810)中釋放1 μmol無機(jī)磷，即為1個植酸酶活性單位，以A表示。植酸酶活性A計算公式如下：

A=K[D600 nm(樣品)-D600 nm(空白)]/30。

式中：A為樣品植酸酶活性；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；30為反應(yīng)時間(min)。

1.5.2 植酸酶活性測定 挑取單菌落于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，培養(yǎng)過夜，按接種量10%接種于裝有200 mL ASW(含5 g MgCl2·6H2O、5 g MgSO4·7H2O、500 mg KCl、500 mg CaCl2、20 g NaCl、3 g胰蛋白胨、1.5 g大豆蛋白胨、5 g葡萄糖)液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、170 r/min，連續(xù)5 d，每隔12 h取樣1次。

該產(chǎn)酶培養(yǎng)基參照ldriss等的方法[16]并稍作修改，植酸酶活性測定參照Choi等方法[17]并稍作修改，具體步驟見表2。

表2 植酸酶活性測定步驟

注：表中各個處理的總體積均為3.0 mL。

1.6 小麥促生長試驗(yàn)

1.6.1 室內(nèi)拌種促生長試驗(yàn) 用滅菌水將CY18分別稀釋為B200、B500、B1 000處理，濃度分別為2.5×108、1.0×108、5.0×107CFU/mL，另設(shè)清水對照(CK)，取上述不同濃度菌液各10 mL，分別放入已標(biāo)記好的培養(yǎng)皿中，再將表面消過毒的小麥品種川麥107分別放入培養(yǎng)皿中拌種10 min，晾干后，將種子放入裝有土的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿20粒種子，各個處理3次重復(fù)，共8個處理。以后根據(jù)土壤干濕狀況澆清水，以保持土壤濕潤，室內(nèi)培養(yǎng)。5 d后調(diào)查小麥植株生長狀況，分別測定其鮮質(zhì)量、株高、根長，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.6.2 小區(qū)浸種促生長試驗(yàn) 參照“1.6.1”節(jié)，用滅菌水將CY18分別稀釋為B200、B500、B1 000處理，另設(shè)清水對照(CK)，將已消毒的小麥品種川麥107種子于上述不同濃度菌液中浸種1 h后晾干，立即播種于事先劃分好的田間小區(qū)內(nèi)。每個重復(fù)播50粒種子。各個處理3次重復(fù)，共8個處理。18 d后調(diào)查小麥植株生長狀況，分別測定其鮮質(zhì)量、株高、根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 潛在促生菌株的篩選及植酸酶基因編碼區(qū)的擴(kuò)增

經(jīng)過解磷菌篩選培養(yǎng)基篩選，從晉寧、屏邊、玉溪、元江等地的作物根圍共篩選出4株具有解磷作用的菌株，即CY12、CY18、CY20、CY48。通過設(shè)計特異引物，對其進(jìn)行特異性PCR電泳檢測結(jié)果表明，這4個菌株均擴(kuò)增出1個 963 bp 的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期條帶大小一致。然后選出解磷效果最好的(即透明消解圈最大的)菌株CY18(圖2)，經(jīng)革蘭氏染色、芽孢染色，初步確定該菌株為芽孢桿菌，并對其進(jìn)行促生長試驗(yàn)。

2.2 CY18菌株植酸酶基因序列分析

將得到的序列通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST比對，找出與已公布的植酸酶基因序列同源性較高的一系列序列，通過生物學(xué)軟件DNAMAN5.2.10.1、TreeView X 0.5.0進(jìn)行核酸序列分析。通過BLAST比對，CY18菌株與已經(jīng)在GenBank中登錄的13條植酸酶基因核苷酸序列的平均同源性高達(dá)97%，同源性范圍為91.5%～99.7%(表3)。遺傳距離范圍為0.003～0.085(表4)，遺傳距離最近的為EU624118。從系統(tǒng)進(jìn)化樹和同源樹來看，按進(jìn)化中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近明顯分為兩大進(jìn)化源，其中AF453255與AY836773、AF029053、AJ277890為第一大進(jìn)化源，其余的為第二大進(jìn)化源，CY18屬于第2大進(jìn)化源(圖3、圖4)。

2.3 不同培養(yǎng)時間植酸酶活性的變化

2.3.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)“1.5.1”節(jié)的步驟，對6個梯度的磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，按植酸酶活性測定步驟，以無機(jī)磷含量為縱坐標(biāo)(0.2 mL稀釋液中的無機(jī)磷含量分別為0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μmol)、以D600 nm為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。

2.3.2 CY18菌株不同時間植酸酶活性變化 由圖6可知，CY18菌株植酸酶活性在前36 h變化緩慢，后來較快上升，72 h 時的酶活性為0.012 5 U，再以后緩慢上升直到108 h時活性達(dá)到最高值，為0.013 6 U，此后活性又極速下降。

2.4 拌種、浸種處理對小麥促生長效果

就拌種而言，不同處理對小麥發(fā)育前期各生物學(xué)指標(biāo)有不同程度的影響(表5)。B200、B500、B1 000處理與對照相比在鮮質(zhì)量、株高、根長上作用效果整體趨勢一致，都表現(xiàn)出高濃度抑制、低濃度促生的效應(yīng)，中濃度促生效果最好。B500處理與對照相比，鮮質(zhì)量、株高、根長分別增加5.56%、22.87%、52.25%，差異達(dá)到極顯著水平(除鮮質(zhì)量外)。

表3 14條芽孢桿菌植酸酶基因核苷酸序列同源性比較結(jié)果 %

表4 14條芽孢桿菌植酸酶基因核苷酸序列距離

就浸種而言，不同濃度梯度浸種小麥對生育前期各個指標(biāo)影響各異，由圖7可以看出，效果比較好的是B1 000處理，與對照相比在株高、鮮質(zhì)量上分別增加16.43%、34.18%，但以上處理對根長均無明顯影響。

表5 CY18菌液拌種在室內(nèi)對小麥鮮質(zhì)量、株高和根長的影響

注：表中數(shù)據(jù)均為“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫、大寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

3 討論

3.1 PGPR對植物的促生效應(yīng)

植物根圍、根際細(xì)菌促進(jìn)植物生長的重要性眾所周知[18-19]。de Freitas等報道，假單胞菌能夠刺激小麥的生長[20]。當(dāng)豌豆、大豆的種子用根圍細(xì)菌浸泡后，其根莖的生長和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收量都會增加[21-22]。H?flich等報道，通過根圍密切相關(guān)的細(xì)菌促進(jìn)植物生長的機(jī)制更可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)的流動、植物激素的產(chǎn)生、對土傳植物病原物的拮抗形成的[19，23]。根圍細(xì)菌棲居在有機(jī)質(zhì)相對豐富的根表，并合成植物生長素，可作為一種次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物的生長。植物激素對植物的生長調(diào)節(jié)發(fā)揮著非常重要的作用，它們可以促進(jìn)種子萌發(fā)、根的延長、增加葉面積[24]。Patten等研究表明，產(chǎn)植物激素是一個細(xì)菌促進(jìn)植物生長的重要因素，它們在低濃度下，通過改變生理學(xué)和形態(tài)學(xué)過程來調(diào)控植物生長。前人已經(jīng)在假單胞菌屬中的多個種中發(fā)現(xiàn)它們可以合成IAA，從而影響根的生長[25]。國內(nèi)外利用微生物促進(jìn)植物生長成功的例子很多，但大多數(shù)集中于假單胞菌、芽孢桿菌屬中，微生物肥料雖然在近10年逐步受到重視，但仍處于摸索發(fā)展階段，目前，增加農(nóng)作物的產(chǎn)量主要依靠化學(xué)肥料，施用化學(xué)肥料雖然見效快，但是由于長期大量施用同類化學(xué)肥料，不僅對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，而且給人畜的健康也帶來了威脅，造成大量有毒的化學(xué)成分累積，如重金屬中毒等。因此，有必要大力提倡推廣微生物的應(yīng)用，篩選能有效促進(jìn)植物生長的生物資源。

本研究表明，從根圍分離出來的細(xì)菌也能夠顯著促進(jìn)小麥的生長，應(yīng)用于促生長的菌株CY18可能的促生機(jī)制是一種激素，也表現(xiàn)出高濃度抑制，低濃度效果不明顯，只有在適合的濃度才能發(fā)揮更好的作用，另一個可能的機(jī)制就是菌株產(chǎn)生植酸酶，能更有效地吸收中等肥力土壤中的磷元素，從而促進(jìn)植物的生長。據(jù)報道，土壤中僅有0.1%的總磷可被植物利用[26-27]，大部分以植酸或植酸鹽的形式貯存起來。在本研究中，應(yīng)用的菌株可以擴(kuò)增出植酸酶基因的部分編碼區(qū)，所以猜測這也是促生長的一個機(jī)制，但是該菌株只表現(xiàn)出表觀的促生效應(yīng)，沒有對其主要病害進(jìn)行調(diào)查。因此，對于病害的發(fā)生與前期生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系就不是很清楚，是否由于控制了病害而間接地促進(jìn)植物生長，還有待后人進(jìn)一步研究。由于時間有限，筆者只是對該菌株應(yīng)用于低磷條件下對農(nóng)作物的促生效果進(jìn)行初步研究，至于在什么樣的磷肥水平下菌株的解磷效果最好且促生效果最佳，還需后人進(jìn)一步研究。

3.2 對菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化及對菌株進(jìn)行遺傳改良的必要性

細(xì)菌的生長繁殖依賴于從周圍環(huán)境中吸收營養(yǎng)物質(zhì)[28-29]。因此，培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分的比例是否適合細(xì)菌的生長，以及是否適合活性物質(zhì)的產(chǎn)生，會在很大程度上影響目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[30]。實(shí)踐表明，培養(yǎng)基的配方不僅是決定活性物質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，其營養(yǎng)成分的比例也決定活性物質(zhì)的種類，除培養(yǎng)基影響外，菌株的代謝活性與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，尤其受溫度、接種量影響較大[31]。因此，在確立促生作用的主要機(jī)制后，必須針對目標(biāo)方向摸索不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、接種量、轉(zhuǎn)速等影響因素的最優(yōu)組合，力求使目標(biāo)產(chǎn)物最大化。此外，選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時間，使目標(biāo)產(chǎn)物達(dá)到最高且穩(wěn)定，這樣有利于分離、提純活性物質(zhì)。如果條件允許，針對具體菌株的具體情況，探索不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、接種量、轉(zhuǎn)速等條件的最佳組合，將會大大提高目標(biāo)活性物質(zhì)的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。除優(yōu)化培養(yǎng)基條件、發(fā)酵條件外，利用物理或化學(xué)方法對菌株進(jìn)行誘變，或利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)對菌株進(jìn)行遺傳改良，均是提高目標(biāo)活性物質(zhì)產(chǎn)量的有效途徑。關(guān)于細(xì)菌菌株的誘變改良，前人已做過大量試驗(yàn)，并在不少菌株上取得了成功，盧文軒等采用低能氮離子束注入技術(shù)成功對硅酸鹽細(xì)菌進(jìn)行誘變，經(jīng)過初篩、復(fù)篩選出解鉀能力強(qiáng)的硅酸鹽細(xì)菌S-05，發(fā)酵液50倍稀釋處理組速效鉀含量最高，分別比原菌株處理組(CK1)、空白對照組(CK2)提高55.79%、260.84%[32]。趙志浩等通過紫外線、硫酸二乙酯交替處理篩選出1株產(chǎn)菌量和芽孢生成量較高的突變株P(guān)E-R，其產(chǎn)量約是原菌株的2倍[33]。對熒光假單胞桿菌進(jìn)行物理或化學(xué)誘變改良或進(jìn)行基因改造，以提高其抗病能力、增強(qiáng)適應(yīng)性，近些年來已有越來越多的研究報道。

4 結(jié)論

通過土壤平板稀釋法，從玉米根圍分離到1株解磷作用較強(qiáng)的芽孢桿菌CY18。CY18浸種、拌種對小麥等有明顯的促生長效應(yīng)，在濃度不同時，促生長效應(yīng)明顯不同：中濃度效果最佳，低濃度和高濃度效果不太理想。

[1]楊海蓮，孫曉璐，宋 未.植物內(nèi)生細(xì)菌的研究[J].微生物學(xué)通報，1998，25(4)：224-227.

[2]丁延芹，王建平，劉 元，等.幾株固氮芽孢桿菌的分離與鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2004，12(6)：690-697.

[3]Anderson M D，Hollingsworth C S，Vanzee V，et al.Consumer response to integrated pest management and certification[J].Agriculture Ecosystems & Environment，1996，60(2/3)：97-106.

[4]Tahmatsidou V，O’Sullivan J，Cassells A C，et al.Comparison of AMF and PGPR inoculants for the suppression ofVerticilliumwilt of strawberry (Fragaria×ananassacv.Selva)[J].Applied Soil Ecology，2006，32(3)：316-324.

[5]Orhan E，Esitken A，Ercisli S，et al.Effects of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) on yield，growth and nutrient contents in organically growing raspberry[J].Scientia Horticulturae，2006，111(1)：38-43.

[6]Ness R L L，Vlek P L G.Mechanism of calcium and phosphate release from hydroxy-apatite by mycorrhizal hyphae[J].Soil Science Society of America Journal，2000，64(3)：949-955.

[7]Marschener H.Role of root growth，arbuscular mycorrhiza，and root exudates for the efficiency in nutrient acquisition[J].Field Crops Research，1998，56(1/2)：203-207.

[8]Bethlenfalvay G J.Mycorrhizae in the agricultural plant-soil system[J].Symbiosis，1993，14：413-425.

[9]Aslantas R，Cakmakci R，Sahin F.Effect of plant growth promoting rhizobacteria on young apple tree growth and fruit yield under orchard conditions[J].Scientia Horticulturae，2007，111(4)：371-377.

[10]黃壽煦.生物肥料對玉米生長及產(chǎn)量影響[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2004(5)：92-93.

[11]裴潤梅，梁 和，范稚蓮，等.桂樂牌復(fù)合微生物肥料對甜玉米產(chǎn)量品質(zhì)及土壤特性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2003，19(4)：131-133.

[12]孫國波.新型微生物肥料對玉米生長及產(chǎn)量的影響[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2006(3)：129.

[13]王彥才，李培富，康 義.玉米施用復(fù)合微生物肥料“農(nóng)夫樂”的效果[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2001，22(2)：19-21.

[14]吳建峰，林先貴.我國微生物肥料研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].土壤，2002，34(2)：68-72.

[15]王明友，李光忠，陳洪美.小麥、玉米施用微生物接種劑增產(chǎn)效應(yīng)初報[J].土壤肥料，2001(3)：44-47.

[16]Idriss E E，Makarewicz O，F(xiàn)arouk A，et al.Extracellular phytase activity ofBacillusamyloliquefaciensFZB45 contributes to its plant-growth- promoting effect[J].Microbiology，2002，148(7)：2097-2109.

[17]Choi Y M，Suh H J，Kim J M.Purification and properties of extracellular phytase fromBacillussp.KHU-10.[J].Journal of Protein Chemistry，2001，20(4)：287-292.

[18]Germida J J，Siciliano S D，de Freitas J R.Diversity of root-associated bacteria associated with field-grown canola(BrassicanapusL.) and wheat(TricumaestivumL.)[J].FEMS Microbiol Ecol，1998，26(1)：43-50.

[19]H?flich G，Wiehe W，Kühn G，et al.Plant growth stimulation with symbiotic and associative rhizosphere microorganisms[J].Experientia，1994，50(10)：897-905.

[20]de Freitas J R，Germida J J.Growth promotion of winter wheat by fluorescent pseudomonas under field conditions[J].Soil Biol Biochem，1992，24(11)：1137-1146.

[21]Egamberdiyeva D，H?flich G.Effect of plant growth-promoting bacteria on growth and nutrient uptake of cotton and pea in a semi-arid region of Uzbekistan[J].J Arid Environ，2004，56(2)：293-301.

[22]Groppa M D，Zawoznik M S，Tomaro M L.Effect of co-inoculation withBradyrhizobiumjapanicumandAzospirillumbrasilenseon soybean plants[J].European J Soil Biol，1998，34(2)：75-80.

[23]Lifshitz R，Kloepper J W，Kozlowski M，et al.Growth promotion of canola (rapeseed) seedlings by a strain ofPseudomonasputidaunder gnotobiotic conditions[J].Canadian J Microbiol，1987，33(5)：390-395.

[24]Zimmer W，Kloos K，Hundeshagen B，et al.Auxin biosynthesis and denitrification in plant growth promotion bacteria[J].Ecological Science，1995，37：121-128.

[25]Patten C L，Glick B R.Role ofPseudomonasputidaindoleacetic acid in development of the host plant root system[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68(8)：3795-3801.

[26]Peix A，Rivas-Boyero A A，Mateos P F，et al.Growth promotion of chickpea and barley by a phosphate solubilizing strain ofMesorhizobiummediterraneumunder growth chamber conditions[J].Soil Biology & Biochemistry，2001，33(1)：103-110.

[27]Tilak.K V B R，Ranganayaki N，Pal K K，et al.Diversity of plant growth and soil health supporting bacteria[J].Current Science，2005，89(1)：136-150.

[28]鐘正丹，何義國，趙興秀，等.白酒酒糟中抗氧化乳酸菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(7)：533-536.

[29]李文利，傅以鋼，劉征宇，等.基于溶藻效果的溶藻細(xì)菌A21培養(yǎng)基成分優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(12)：516-520.

[30]吳磊明，余曉冬.影響抗生素效價的研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，1996，12(7)：486-487.

[31]羅 鵬，許煜泉，張 霞，等.熒光假單胞菌株M18產(chǎn)PCA發(fā)酵條件研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，18(2)：66-71.

[32]盧文軒，蔣立科，羅 曼.離子束注入硅酸鹽細(xì)菌誘變選育研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，25(6)：636-639.

[33]趙志浩，徐銀榮，徐銀秀.鉀細(xì)菌誘變選育和發(fā)酵的研究[J].生物技術(shù)，2004，14(6)：50-52.