煙草懸浮細(xì)胞系的構(gòu)建

孔 瓊，袁盛勇，肖亞楠，楊文超，陳俊梅，蔣雙番，史艷春，楊 升

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661100)

煙草(NicotianatabacumL.)為茄科煙草屬的一年生草本植物，已成為當(dāng)前生物學(xué)研究最為深入的模式植物材料，尤其在植物分子生物學(xué)、基因組學(xué)等方面應(yīng)用最為廣泛。植物懸浮細(xì)胞因具有均一性好、條件易控制、培養(yǎng)周期短、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)等研究中[1]。因此，建立穩(wěn)定且活性高的煙草懸浮細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，是開(kāi)展后期試驗(yàn)的重要保證之一。植物懸浮細(xì)胞的建立受很多因素的影響，其中愈傷組織的成功獲得和單細(xì)胞形成是兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，同時(shí)激素種類(lèi)及濃度、接種量、蔗糖濃度、轉(zhuǎn)速等也是關(guān)鍵影響因素[2-3]。本研究以煙草的幼嫩莖髓為試驗(yàn)材料，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，分析不同營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)的影響，從而建立煙草懸浮細(xì)胞系的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以煙草BY-2品種為試驗(yàn)材料，煙草種子由昆明學(xué)院楊紅玉教師惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 將煙草幼莖切成1 cm長(zhǎng)段，用70%乙醇消毒30 s后，再轉(zhuǎn)入5%次氯酸鈉中消毒 7 min，無(wú)菌水漂洗4～5次后用無(wú)菌濾紙吸干水分，切取莖髓，轉(zhuǎn)入9種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，基本配方為MS+30 mg/L 蔗糖+14 mg/L瓊脂，具體激素配比見(jiàn)表1。于 26 ℃ 暗培養(yǎng)3周，觀察并記錄愈傷組織的生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)出愈率和鮮質(zhì)量。計(jì)算公式：接種量=接種后瓶質(zhì)量(g/皿)-接種前瓶質(zhì)量(g/皿)；愈傷組織鮮質(zhì)量=收獲量(g/皿)-接種量(g/皿)；出愈率=(誘導(dǎo)出愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

綜合比較9種培養(yǎng)基上愈傷組織的生長(zhǎng)速度、出愈率、鮮質(zhì)量、形狀、分散性、顏色等指標(biāo)，篩選出誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)的最佳配方，并將其配方作為愈傷組織繼代和懸浮培養(yǎng)的配方。

1.2.2 懸浮細(xì)胞系的建立

1.2.2.1 不同接種量對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 選取白色疏松的愈傷組織1、2、3、4 g分別接種于150 mL液體培養(yǎng)基(“1.2.1”節(jié)中的配方)中，于26 ℃、140 r/min搖床振蕩暗培養(yǎng)8 d后測(cè)定細(xì)胞鮮質(zhì)量，3次重復(fù)。

1.2.2.2 蔗糖濃度對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將“1.2.2.1”節(jié)中最佳接種量培養(yǎng)10 d后的20 mL懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)接到含有10、20、30、40、50 g/L蔗糖的130 mL新鮮液體培養(yǎng)基(“1.2.1”節(jié)中的配方)中，3次重復(fù)，于26 ℃、140 r/min搖床振蕩暗培養(yǎng)8 d后測(cè)定細(xì)胞鮮質(zhì)量。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 選用“1.2.2.1”節(jié)和“1.2.2.2”節(jié)篩選出的最佳接種量和蔗糖濃度，制成液體培養(yǎng)基，分別于100、110、120、130、140、150 r/min的恒溫?fù)u床上于26 ℃振蕩暗培養(yǎng)8 d后測(cè)定細(xì)胞鮮質(zhì)量，3次重復(fù)。

1.2.3 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、活性變化及pH值變化 根據(jù)“1.2.2.1”節(jié)、“1.2.2.2”節(jié)和“1.2.2.3”節(jié)篩選出的最佳結(jié)果，將懸浮細(xì)胞于26 ℃振蕩培養(yǎng)12 d，每隔2 d取樣測(cè)定細(xì)胞鮮質(zhì)量、pH值和細(xì)胞活性，確定其生長(zhǎng)周期。

1.2.4 數(shù)值測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)胞鮮質(zhì)量 根據(jù)李建安等介紹的方法[4]，具體操作：取充分混勻懸浮細(xì)胞8 mL，注入預(yù)先稱(chēng)質(zhì)量的10 mL離心管中，在3 500 r/min下離心10 min，吸去上清液，室溫下敞口自然風(fēng)干24 h后稱(chēng)質(zhì)量，減去空管質(zhì)量即為8 mL懸浮細(xì)胞的鮮質(zhì)量。

1.2.4.2 細(xì)胞活性測(cè)定 按照孔瓊等介紹的方法[5]進(jìn)行。即將0.2 g細(xì)胞加入3 mL 0.6% TTC溶液(用50 mmol/L pH值 7.5 磷酸緩沖液配制，內(nèi)含0.05% Tween-20)，26 ℃暗培養(yǎng)24 h，3 500 r/min離心10 min，細(xì)胞轉(zhuǎn)入大試管中后加入95%乙醇5 mL，80 ℃水浴20 min，冷卻后3 500 r/min離心 10 min，取上清液于485 nm進(jìn)行比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草BY-2愈傷組織誘導(dǎo)

為了研究不同激素組合對(duì)煙草BY-2愈傷組織誘導(dǎo)的影響，分別對(duì)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察分析。結(jié)果顯示，8種激素配比的培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)煙草莖髓長(zhǎng)出愈傷組織，但愈傷組織產(chǎn)生的數(shù)量和性狀之間存在明顯差異(表1)。其中配方1、2和3中莖髓培養(yǎng)第3天時(shí)，莖髓邊緣開(kāi)始膨脹變大；7 d時(shí)，切口兩端開(kāi)始愈傷化，邊緣產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的乳白色顆粒狀愈傷組織；21 d后，出現(xiàn)結(jié)構(gòu)疏松、生長(zhǎng)旺盛的白色愈傷組織。但配方3中的愈傷組織獲得量和顏色質(zhì)地顯著高于配方1、2中的誘導(dǎo)結(jié)果，出愈率高達(dá) 93.3%。而配方4未明顯獲得愈傷組織。配方5和7中獲得的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，伴有褐化現(xiàn)象。配方6、8和9中的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，質(zhì)地致密。因此，在誘導(dǎo)煙草BY-2愈傷組織過(guò)程中，激素2，4-D和6-BA配合使用比NAA、2，4-D和6-BA混合使用更能有效地促進(jìn)愈傷組織產(chǎn)生和生長(zhǎng)，且配方3(MS+3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA)為誘導(dǎo)煙草BY-2愈傷組織生長(zhǎng)的最佳配方。

表1 不同植物激素組合對(duì)煙草BY-2愈傷組織的誘導(dǎo)情況

注：采用最小顯著差數(shù)法(LSD)評(píng)價(jià)差異顯著性，表中數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。表2同。

2.2 懸浮細(xì)胞系構(gòu)建

2.2.1 不同接種量對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 初始接種量對(duì)懸浮細(xì)胞系的生長(zhǎng)有著明顯影響，細(xì)胞需要達(dá)到一定的起始密度才能進(jìn)行生長(zhǎng)，但濃度過(guò)大又需要消耗大量的養(yǎng)分。因此，選擇適宜的接種量是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一個(gè)重要的因素。不同接種量對(duì)煙草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量具有較大影響。由圖1可見(jiàn)，在150 mL液體培養(yǎng)基中，當(dāng)初始接種量為1、2 g時(shí)，煙草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，顯著低于3 g和4 g的初始接種量；初始接種量為3 g時(shí)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，第8天后，8 mL 細(xì)胞鮮質(zhì)量高達(dá)(0.727 3±0.003 8)g。

2.2.2 蔗糖濃度對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 碳源是植物組織培養(yǎng)中的必需營(yíng)養(yǎng)因子，同時(shí)也參與了滲透壓的平衡調(diào)節(jié)，因此起著十分重要的作用。蔗糖濃度對(duì)煙草懸浮細(xì)胞鮮質(zhì)量增加的影響如圖2所示。當(dāng)蔗糖濃度為1%、2%時(shí)，煙草細(xì)胞增殖不明顯且差異不顯著；而蔗糖濃度為3%、4%、5%時(shí)，細(xì)胞增殖較快，且差異顯著，尤其是濃度為3%時(shí)，細(xì)胞增殖最快，顯著高于其他處理。

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 不同的轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞的分散性、長(zhǎng)勢(shì)和貼壁現(xiàn)象具有較大的影響。在最佳接種量和蔗糖濃度下，轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)也有不同的影響，過(guò)高或過(guò)低均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為l10～120 r/min時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞鮮質(zhì)量增加不明顯，細(xì)胞分散性差，容易在短時(shí)間內(nèi)形成較大的細(xì)胞團(tuán)；轉(zhuǎn)速為130～140 r/min時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較快，分散性好，且140 r/min時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)8 d后8 mL細(xì)胞鮮質(zhì)量高達(dá)(0.639 5±0.009 4)g，鮮質(zhì)量高于其他處理；而當(dāng)轉(zhuǎn)速高達(dá)150 r/min時(shí)，細(xì)胞增長(zhǎng)量有所下降，且易出現(xiàn)污染問(wèn)題，貼壁死細(xì)胞較多(表2)。因此適宜煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為140 r/min，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2.4 煙草BY-2懸浮細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線、pH值及活性變化 在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，測(cè)定了煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞鮮質(zhì)量和pH值變化，并繪制了其生長(zhǎng)曲線。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)量近“S”形規(guī)律，鮮質(zhì)量變化趨勢(shì)明顯，且與活性變化密切相關(guān)，而培養(yǎng)液中pH值呈下降趨勢(shì)(圖3和圖4)。延遲期(1～2d)和對(duì)數(shù)期(3～10d)明顯，且在對(duì)數(shù)期時(shí)，細(xì)胞增殖明顯，當(dāng)培養(yǎng)到10 d時(shí)，細(xì)胞鮮質(zhì)量達(dá)到最大值。根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性變化與生長(zhǎng)量變化相似，且在培養(yǎng)8 d時(shí)達(dá)到最高值，活性最好。因此結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)量變化，煙草懸浮細(xì)胞的繼代周期為8 d。

表2 轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞鮮質(zhì)量的影響

3 結(jié)論與討論

在植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，激素是愈傷組織誘導(dǎo)和懸浮細(xì)胞構(gòu)建的關(guān)鍵因素之一，不同激素種類(lèi)和濃度配比后，其相互作用可影響其形態(tài)建成方向[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)添加一定濃度的2，4-D和6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)具有很大的促進(jìn)作用，且2，4-D是禾谷類(lèi)植物產(chǎn)生愈傷組織所必需的生長(zhǎng)物質(zhì)[7-8]。本研究在煙草愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)2，4-D和6-BA配比后的重要作用，且最佳誘導(dǎo)配比為3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA。因此，合適的激素種類(lèi)和濃度配比是愈傷組織獲取和改善狀態(tài)的重要前提。

初始接種量和蔗糖的多少對(duì)懸浮細(xì)胞系建立也起著重要作用。大多數(shù)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)具有群聚效應(yīng)，細(xì)胞密度過(guò)低或過(guò)高都不利于懸浮細(xì)胞系的建立，而合適的密度才能促進(jìn)細(xì)胞快速生長(zhǎng)，細(xì)胞分散性好[9]。在小麥懸浮細(xì)胞系建立過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，初始接種量為0.5～1.5 g(每400 mL培養(yǎng)液)時(shí)，細(xì)胞增殖倍數(shù)隨著接種量的增加而增加，且接種量為1.5 g時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)細(xì)胞系分散性好，顏色鮮艷，如接種量增加，細(xì)胞增殖倍數(shù)呈下降趨勢(shì)，培養(yǎng)液顏色渾濁[10]。同樣的現(xiàn)象也在草莓懸浮細(xì)胞系建立試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[11]。蔗糖濃度過(guò)低，培養(yǎng)物不僅得不到碳源補(bǔ)充，還會(huì)發(fā)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外滲，而過(guò)高則會(huì)出現(xiàn)生理性缺水，兩種情況最終都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。大量試驗(yàn)結(jié)果表明，一般懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中蔗糖濃度一般為20～30 g/L。因此，煙草懸浮細(xì)胞系構(gòu)建的最佳初始接種量為3 g/150 mL，蔗糖濃度為30 g/L。

前人在研究煙草懸浮細(xì)胞系構(gòu)建過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)、分散性和貼壁現(xiàn)象具有較大影響[13]。同樣的現(xiàn)象也表現(xiàn)于本試驗(yàn)中，當(dāng)轉(zhuǎn)速較低(110～120 r/min)時(shí)，懸浮培養(yǎng)基中的氧含量較低，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，機(jī)械力較小，分散性較差，易結(jié)成團(tuán)；而當(dāng)轉(zhuǎn)速較高(150 r/min)時(shí)，可能易發(fā)生機(jī)械損傷，死細(xì)胞較多。因此合適的轉(zhuǎn)速也是懸浮細(xì)胞成功構(gòu)建的關(guān)鍵因子。

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