小麥花藥液體漂浮離體培養(yǎng)體系的建立與應(yīng)用

趙林姝，何子偉，劉 麗，古佳玉，謝永盾，郭會(huì)君，趙世榮，李軍輝，熊宏春，丁玉萍，劉錄祥

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國(guó)家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心/作物分子育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.西澳基礎(chǔ)工業(yè)和農(nóng)村發(fā)展部農(nóng)業(yè)和食品司糧食研發(fā)處雙單倍體育種實(shí)驗(yàn)室，澳大利亞珀斯 6151)

花藥培養(yǎng)技術(shù)在品種選育、DH遺傳群體構(gòu)建、突變體創(chuàng)制及轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)揮著重要作用[1-7]。自20世紀(jì)70年代初首次通過(guò)花藥離體培養(yǎng)方法誘導(dǎo)出小麥花粉植株以來(lái)[8-9]，各國(guó)研究人員通過(guò)對(duì)小麥花藥離體培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法等深入細(xì)致的研究，建立了比較成熟的花藥離體培養(yǎng)體系并廣泛應(yīng)用[10-13]。

小麥花藥離體培養(yǎng)過(guò)程中的脫分化階段有固體培養(yǎng)和液體漂浮培養(yǎng)兩種方式?；ㄋ幰后w漂浮離體培養(yǎng)技術(shù)是在單細(xì)胞水平上獲得純系的培養(yǎng)方法，既具有固體培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)又解決了固體培養(yǎng)方法中存在的細(xì)胞壁及其他組織干擾的問(wèn)題，利用此方法培養(yǎng)的花藥在離體培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)釋放成千上萬(wàn)個(gè)小孢子到液體培養(yǎng)基中，且釋放的花粉小孢子無(wú)損傷，因此具有產(chǎn)生更多花粉苗的潛力。研究表明，液體漂浮培養(yǎng)方式具有較好的愈傷誘導(dǎo)及分化效果[14-15]。Broughton[16]建立了一套適于澳大利亞春小麥花藥離體培養(yǎng)的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(LIM,Liquid induction medium)及花藥培養(yǎng)程序，利用此方法對(duì)10個(gè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的春小麥品種進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，結(jié)果表明，10個(gè)品種中有9個(gè)能再生出綠苗，綠苗產(chǎn)率變異范圍為0.00%～56.90%，其中50%品種的綠苗產(chǎn)率高于5%；該實(shí)驗(yàn)室利用此套液體漂浮離體培養(yǎng)體系，結(jié)合溫室加代的種植模式，每年可生產(chǎn)2萬(wàn)余花粉植株。

目前，國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室小麥花藥離體培養(yǎng)過(guò)程中的脫分化階段基本是利用固體培養(yǎng)方式，不同研究團(tuán)隊(duì)采用的培養(yǎng)基不同，主要是C17[17]、W14[18]、癸培養(yǎng)基[19]三種，例如本研究團(tuán)隊(duì)以C17培養(yǎng)基為主[20]，韓曉峰等[21]及王成社等[22]則以W14培養(yǎng)基為主，河南農(nóng)科院小麥所研制的癸培養(yǎng)基適用于黃淮麥區(qū)小麥花藥培養(yǎng)的脫分化培養(yǎng)[19]。為研究小麥花藥液體漂浮離體培養(yǎng)體系的培養(yǎng)效果，本研究團(tuán)隊(duì)抑利用Sue[16,23]建立的液體培養(yǎng)體系，對(duì)部分冬小麥品種(系)進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，并對(duì)幼穗低溫預(yù)處理的效果進(jìn)行研究，以探討該花培體系用于我國(guó)小麥品種(系)離體培養(yǎng)的可行性，為尋找高效的小麥花藥離體培養(yǎng)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為本研究團(tuán)隊(duì)保存的小麥品種(系)Pavons、Chris、矮抗58、周麥18、H307、H341S、石4185及S6123，于2016年盆栽于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所北圃場(chǎng)溫室，生長(zhǎng)期溫度控制在16～30 ℃之間，苗期施緩釋肥一次，全生育期防治蚜蟲及白粉病。

1.2 花藥培養(yǎng)

選取花粉粒發(fā)育至單核中晚期(一般在打苞期，穗子尚未露出旗葉葉鞘時(shí))的小麥幼穗，接種前將穗子剝出，用2%次氯酸鈉滅菌30 min，超凈臺(tái)中無(wú)菌蒸餾水沖洗3～4次備用。液體漂浮離體培養(yǎng)的接種方法及培養(yǎng)基參照Broughton[16]的方法，固體培養(yǎng)為C17培養(yǎng)基[20]。

實(shí)驗(yàn)一：選取小麥品種(系)矮抗58、周麥18、H307、H341S、石4185及S6123的適期幼穗進(jìn)行接種，研究液體漂浮培養(yǎng)及固體培養(yǎng)方法對(duì)小麥的培養(yǎng)效果。每個(gè)品種(系)6個(gè)穗子，每穗接種花藥60枚。

實(shí)驗(yàn)二：選取小麥品種Pavons及Chris的適期幼穗，留莖稈10～15 cm，將幼穗放入裝有水的燒杯中，錫箔紙包裹放入 4 ℃冰箱分別處理3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d，未進(jìn)行低溫預(yù)處理的幼穗作為對(duì)照，研究低溫預(yù)處理對(duì)小麥花藥液體漂浮離體培養(yǎng)特性的影響。每處理6個(gè)穗子，每穗接種花藥60枚。

1.3 花藥培養(yǎng)特性統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù))×100%；

綠苗分化率=(產(chǎn)生的綠苗數(shù)/轉(zhuǎn)分化愈傷數(shù))×100%；

綠苗產(chǎn)率=(產(chǎn)生的綠苗數(shù)/接種花藥數(shù))×100%；

白苗分化率=(產(chǎn)生的白苗數(shù)/轉(zhuǎn)分化愈傷數(shù))×100%；

白苗產(chǎn)率=(產(chǎn)生的白苗數(shù)/接種花藥數(shù))×100%。

用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行各性狀低溫預(yù)處理間的多重比較分析(最小顯著差異法，LSD)，SigmaPlot軟件繪制低溫處理花培特性折線圖，Excel進(jìn)行平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤用的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體漂浮離體培養(yǎng)過(guò)程中小麥花藥的脫分化及再分化

單核中晚期花藥(圖1A)接種于液體培養(yǎng)基后藥壁開(kāi)裂，其中小孢子散落到液體培養(yǎng)基中(圖1B)，利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)接種3 d后的液體培養(yǎng)基中的小孢子數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，每毫升培養(yǎng)基中小孢子數(shù)可達(dá)到50 000左右。接種15 d后培養(yǎng)基中肉眼可見(jiàn)白色顆粒狀物質(zhì)，30 d可見(jiàn)脫分化形成的帶有胚芽的胚狀體(圖1C)；之后將胚狀體轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，7 d左右可分化出苗(圖1D)，15 d后即可將分化出的苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。

A: 單核靠邊期小孢子; B: 接種3 d后釋放到液體培養(yǎng)基中的小孢子; C: 培養(yǎng)30 d產(chǎn)生的胚狀體; D: 再生的綠色植株。

A: Microspores at the late uninucleate stage; B: Microspores released from the anther suspension cultured for 3 days; C: Embryos after 30 days of anther culture; D: Regenerated green plantlets.

圖1小麥花藥液體漂浮培養(yǎng)的脫分化及再分化

Fig.1Dedifferentiationandredifferentiationofanthersuspensioncultureinwheat

2.2 兩種離體培養(yǎng)方式下不同小麥品種(系)的花藥培養(yǎng)特性

由表1可以看出，液體漂浮離體培養(yǎng)(LIM)方式下，各被測(cè)指標(biāo)在品種(系)間差異程度不同；固體培養(yǎng)(C17)方式下，被測(cè)指標(biāo)中，愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率及綠苗產(chǎn)率在品種(系)間差異程度不同。液體漂浮離體培養(yǎng)方式下，各品種(系)的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、綠苗產(chǎn)率、白苗分化率和白苗產(chǎn)率變異范圍分別為116.48%～633.33%、5.79%～95.42%、10.25%～274.29%、3.27%～80.95%及6.11%～111.03%；固體培養(yǎng)方式下，各品種(系)的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、綠苗產(chǎn)率、白苗分化率和白苗產(chǎn)率變異范圍分別為6.64%～31.44%、0.67%～70.02%、0.13%～16.39%、1.67%～14.92%及0.40%～2.11%。各被測(cè)指標(biāo)液體漂浮培養(yǎng)方式品種(系)間的變異范圍均高于固體培養(yǎng)方式。除了H307的白苗分化率表現(xiàn)為固體培養(yǎng)方式高于液體培養(yǎng)方式外，各品種(系)其他被測(cè)指標(biāo)均表現(xiàn)出液體培養(yǎng)方式高于固體培養(yǎng)方式，所研究品種(系)液體漂浮培養(yǎng)方式的愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗分化率、綠苗產(chǎn)率、白苗分化率和白苗產(chǎn)率，分別是固體培養(yǎng)方式相應(yīng)性狀的3.70～94.95倍、1.24～8.65倍、2.54～149.54倍、2.93～36.11倍和4.77～219.63倍，說(shuō)明液體培養(yǎng)方式較固體培養(yǎng)方式可獲得更多的愈傷及綠苗，但同時(shí)也出現(xiàn)了較多的白苗。

除綠苗分化率在液體漂浮培養(yǎng)及固體培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式下表現(xiàn)的品種(系)排序完全一致外，其他各性狀在兩種培養(yǎng)方式下表現(xiàn)較好的品種(系)并不完全一致。液體培養(yǎng)方式下花藥脫分化形成愈傷能力表現(xiàn)最好的品種(系)是石4185，愈傷分化形成綠苗能力表現(xiàn)較好的品種(系)是H307、S6123和H341S，愈傷分化形成白苗較多的品種(系)是周麥18和石4185?；ㄋ幏只纬删G苗能力表現(xiàn)較好的品種(系)是石4185和S6123，花藥分化形成白苗最多的品種(系)是石4185。

2.3 不同低溫預(yù)處理的花藥離體培養(yǎng)特性

由圖2、圖3可以看出，低溫預(yù)處理對(duì)小麥品種Pavons及Chris離體培養(yǎng)性狀的影響各不相同。兩個(gè)品種(系)幼穗的愈傷組織誘導(dǎo)率受低溫預(yù)處理影響均較小，其中，將幼穗低溫放置3 d和9 d的處理均與對(duì)照差異不顯著；小麥品種Chris幼穗在低溫處理6 d后愈傷組織誘導(dǎo)率也與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，但小麥品種Pavons幼穗在低溫處理6 d后愈傷組織誘導(dǎo)率顯著低于對(duì)照，兩個(gè)品種(系)幼穗低溫預(yù)處理12 d、15 d和18 d后的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著降低；與綠苗分化相關(guān)的兩個(gè)指標(biāo)受低溫處理影響較大，且低溫處理后綠苗分化指標(biāo)均表現(xiàn)下降的趨勢(shì)，除了低溫處理15 d的小麥品種Chris的幼穗綠苗產(chǎn)率與對(duì)照無(wú)顯著差異外，兩個(gè)品種(系)其他各低溫處理的幼穗綠苗分化率和綠苗產(chǎn)率均顯著低于對(duì)照；白苗分化率和白苗產(chǎn)率兩個(gè)指標(biāo)，與上述3個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，幼穗經(jīng)低溫預(yù)處理后白苗產(chǎn)率呈上升趨勢(shì)，兩個(gè)品種(系)間具有一定差異。小麥品種Pavons幼穗低溫處理9 d和18 d時(shí)產(chǎn)生的白苗顯著多于對(duì)照，其他各低溫處理與對(duì)照差異不顯著；小麥品種Chris除了低溫處理9 d的幼穗與對(duì)照差異不顯著外，其他各低溫處理產(chǎn)生的白苗數(shù)均顯著多于對(duì)照。

表1 不同小麥品種(系)的花藥培養(yǎng)特性Table 1 Characters of cultured anthers from six different cultivars(lines) of wheat %

LIM：液體漂浮培養(yǎng)；C17：固體培養(yǎng)；同一列數(shù)據(jù)后的不同字母表示品種(系)間存在顯著差異(采用LSD法，P<0.01)。

LIM:invitrosuspension culture; C17:The solid culture method; Means followed by different letters are significantly different among cultivars according to LSD test(P<0.01).

不同字母表示處理間存在顯著差異(采用LSD 法，P<0.05)。下圖同。

Means followed by different letters are significantly different among pretreatments according to LSD test(P<0.05).The same in figure 3.

圖2低溫預(yù)處理對(duì)小麥品種Pavons花培特性的影響

Fig.2Effectoflow-temperaturepretreatmentsontheanthercultureabilityofwheatPavons

圖3 低溫預(yù)處理對(duì)小麥品種Chris花培特性的影響

3 討 論

3.1 花藥液體漂浮培養(yǎng)方法用于小麥離體培養(yǎng)的可行性及應(yīng)用前景

本研究對(duì)6個(gè)小麥品種(系)的花藥液體漂浮離體培養(yǎng)特性的研究表明，各性狀在不同品種(系)間均差異程度不同，說(shuō)明品種(系)間的花藥培養(yǎng)特性是有差異的，此結(jié)果與Broughton[16]的研究結(jié)果一致。6個(gè)品種(系)液體漂浮離體培養(yǎng)方法的出愈及綠苗分化能力均較好，其中，愈傷組織誘導(dǎo)率均高于116.48%，綠苗分化率均高于5.79%，綠苗產(chǎn)率均高于10.25%；說(shuō)明液體漂浮離體培養(yǎng)方法用于國(guó)內(nèi)小麥品種(系)花藥培養(yǎng)是可行的。對(duì)液體漂浮培養(yǎng)及固體培養(yǎng)兩種離體培養(yǎng)方法花培效果的比較研究結(jié)果表明，針對(duì)綠苗產(chǎn)率這一花藥培養(yǎng)特性重要指標(biāo)，各品種(系)的液體漂浮培養(yǎng)效果均好于固體培養(yǎng)方法，特別是對(duì)固體培養(yǎng)方法很難再生綠苗的品種(系)矮抗58(0.13%)和周麥18(0.33%)，液體漂浮培養(yǎng)方法分別獲得了19.44%和10.25%的綠苗產(chǎn)率，分別是固體培養(yǎng)方法的149.54倍和31.06倍。液體漂浮離體培養(yǎng)這一簡(jiǎn)便高效的花藥離體培養(yǎng)技術(shù)有望在小麥單倍體育種工作中發(fā)揮更大作用。

本試驗(yàn)中，6個(gè)品種(系)均分化出較多的白苗，其中，花藥分化形成綠苗能力較強(qiáng)的品種(系)石4185和S6123，白苗分化率均超過(guò)100%，分化綠苗能力最弱的品種(系)周麥18，其白苗產(chǎn)率也超過(guò)50%。但同樣綠苗產(chǎn)率較高的品種(系)H307，其白苗分化率只有6.11%。因此，進(jìn)一步探索影響白苗產(chǎn)生的因素，降低白苗產(chǎn)率，是下一步研究工作的重點(diǎn)。

3.2 低溫預(yù)處理對(duì)小麥花培特性的影響

由于接種能力的限制，實(shí)際工作中常常會(huì)出現(xiàn)田間或溫室取回的樣品當(dāng)天來(lái)不及進(jìn)行接種的問(wèn)題。小麥小孢子離體培養(yǎng)研究結(jié)果表明，幼穗經(jīng)低溫預(yù)處理4～5周可以提高小孢子離體培養(yǎng)過(guò)程中的胚狀體及綠苗獲得率[24]。為了探討4 ℃低溫預(yù)處理對(duì)小麥花藥液體漂浮離體培養(yǎng)效果的影響，本試驗(yàn)選用6個(gè)低溫預(yù)處理時(shí)間，對(duì)兩個(gè)小麥品種Pavons及Chris開(kāi)展了花藥培養(yǎng)特性的研究，結(jié)果表明，兩個(gè)品種(系)的幼穗對(duì)低溫預(yù)處理的反應(yīng)并不完全一致，總體來(lái)說(shuō)，低溫預(yù)處理對(duì)兩個(gè)品種(系)的幼穗均表現(xiàn)出降低愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗獲得率及增加白苗的趨勢(shì)，說(shuō)明低溫預(yù)處理對(duì)小麥花藥液體漂浮離體培養(yǎng)具有負(fù)效應(yīng)。此結(jié)果與小麥小孢子培養(yǎng)[24]及固體培養(yǎng)方法[20-21]需要低溫預(yù)處理不同，可能是由于本試驗(yàn)中對(duì)花藥進(jìn)行了5 d的甘露醇滲透壓預(yù)處理。Chris的幼穗在15 d低溫預(yù)處理時(shí)表現(xiàn)特殊，綠苗產(chǎn)率與對(duì)照差異不顯著，此結(jié)果是否是品種(系)的效應(yīng)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。除了Chris 15 d低溫預(yù)處理外，其他各低溫處理的幼穗雖然綠苗產(chǎn)率顯著低于對(duì)照，但均獲得了一定數(shù)量的綠苗。因此，實(shí)際育種工作中出現(xiàn)無(wú)法在取樣當(dāng)天進(jìn)行接種的情況時(shí)，將幼穗進(jìn)行4 ℃低溫保存后再進(jìn)行接種也不失為一種解決辦法。值得說(shuō)明的是，本研究中低溫預(yù)處理實(shí)驗(yàn)所用材料為春小麥品種，低溫預(yù)處理對(duì)冬小麥品種花藥離體培養(yǎng)特性的影響還有待進(jìn)一步研究。

致謝：本實(shí)驗(yàn)中花藥液體漂浮離體培養(yǎng)技術(shù)得到了西澳基礎(chǔ)工業(yè)和農(nóng)村發(fā)展部農(nóng)業(yè)和食品司糧食研發(fā)處雙單倍體育種實(shí)驗(yàn)室Sue Broughton的悉心指導(dǎo)，在此深表感謝。

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