膠體金免疫層析法測定水產品中孔雀石綠藥物殘留的方法探索

王玉梅

1.材料與方法

1.1 原理

樣品中的孔雀石綠、隱色孔雀石綠經有機試劑提取，吸附劑凈化，正己烷除脂后，加入氧化劑將隱色孔雀石綠氧化成為孔雀石綠，經濃縮復溶后，孔雀石綠與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制了抗體和微孔膜檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠總量進行定性判定。

1.2 儀器

移液器：200μL、1mL和5mL

渦旋混合器

離心機：轉速 ≥4000r/min

電子天平：感量分別為0.01mg 和0.01g

氮吹濃縮儀

恒溫水浴鍋

1.3 試劑盒

四年來，一直用的是無錫中德伯爾生物技術有限公司的孔雀石綠快速檢測試劑盒，開展檢測前，先任意抽取3個檢測卡進行性能驗證，驗證檢測卡是否有效。

1.4 孔雀石綠質控加標液的配制

配制孔雀石綠（無色）標準溶液，濃度為2.0μg/mL，溶劑：乙腈，存放于4℃冰箱，避光保存（有效期1年）。

1.5 檢測流程和方法

檢測方法參照試劑盒里的使用說明書

陰性結果：T線比C線深或一樣深，表示樣本中孔雀石綠濃度低于其檢測限；

陽性結果：T線比C線淺，表示樣本中孔雀石綠濃度高于其檢測限

1.6 檢測條件

檢測條件見表1。

2.檢測結果與討論

2.1 檢測結果見表2

2.2 討論

表1 檢測條件

2.2.1 樣品前處理一定要認真。樣品要求新鮮，取脂肪含量較低部位的肌肉，比如魚，要求去皮、去骨，去脂肪，只取背上的一部分肉；蝦要去頭、去殼，取蝦仁，肉取好后要充分粉碎成肉糜狀，否則肉的顆粒太大，在檢測時，與試劑接觸的面較小，不能充分提取、氧化，最后可能會出現(xiàn)假陰性。我們曾做了對照試驗，對同一樣品采取不同的樣品處置方法，一個是肉糜狀，一個加工粗糙，有骨頭，魚肉用剪刀剪后，沒有充分粉碎，顆粒較大，在樣品中直接添加濃度為3.0μg/kg孔雀石綠標準溶液進行檢測，結果會出現(xiàn)假陰性。

2.2.2 樣品復溶再離心后一定要等明顯分層后取下層液體用于檢測，因為如果有違禁藥物的殘留，在經過一系列的處理后，會溶解在下層液體中，取上層液體就會檢測不出或出現(xiàn)假陰性的情況。

2.2.3 做檢測前必須對本批次的速測盒進行性能驗證，至少抽3個檢測卡用于性能驗證，檢測本批次的速測盒是否有效，是否能檢測出陽性。以免有的速測盒因為存放時間長、保管措施不到位而影響了速測盒的性能。

表2 2013-2016年孔雀石綠檢測結果

2.2.4 注意檢測時間要求，在樣本提取完后要求在10分鐘內進行檢測，待檢樣品溶液在酶標孔中完全溶解，等待反應時間10分鐘，最后判讀檢測卡反應的時間5～8分鐘，所有的檢測要求在規(guī)定時間內完成。

2.2.5 出現(xiàn)假陽性的原因。2013年以來，共有5個樣品檢測結果疑似陽性，后來把疑似陽性的留樣送至省水產品質量檢測中心重新定量檢測，只有1個是陽性，其余是陰性。其原因可能是兩個方面：一是出現(xiàn)了交叉反應，可能試劑盒里的抗原抗體的特異性太差；二是樣品里含有與孔雀石綠分子結構差不多的物質，該物質與試劑盒內的抗原抗體先發(fā)生反應而出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。

（通聯(lián)：226500，江蘇省如皋市如城鎮(zhèn)解放路動植物檢測中心三樓）