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    消化道微生態(tài)標準化樣本庫共識*

    2018-03-04 14:07:07中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會中國醫(yī)學裝備協(xié)會消化病學分會微生態(tài)學組及生物樣本庫學組中華醫(yī)學會消化病學分會微生態(tài)生物樣本庫與轉化醫(yī)學協(xié)作組
    胃腸病學 2018年6期
    關鍵詞:生物生態(tài)信息

    中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會 中國醫(yī)學裝備協(xié)會消化病學分會微生態(tài)學組及生物樣本庫學組 中華醫(yī)學會消化病學分會微生態(tài)、生物樣本庫與轉化醫(yī)學協(xié)作組

    生物樣本庫主要是指標準化采集、處理、儲存和應用健康和疾病生物體的器官、組織、細胞、血液、體液、分泌物、排泄物以及生物大分子衍生物等各種生物樣本,以及與這些樣本相關的臨床、檢驗、病理、影像、治療、隨訪、患者知情同意等信息,包括質量控制、信息管理與應用系統(tǒng)。

    人類消化道生存著眾多微生物,包括細菌、古生菌、真菌、病毒、原蟲等[1]。腸道微生物與宿主長期共同進化,構成腸道微生態(tài),影響著宿主的健康。隨著測序等高通量技術和生物信息學的發(fā)展,以消化道微生態(tài)(主要是細菌和真菌)樣本為基礎的研究將我們對消化道微生態(tài)的認知和應用向前推進了一大步[2],成為國內外重要的研究熱點。消化道微生態(tài)樣本的采集、制備、存儲等是后續(xù)研究的第一步,對檢測和分析結果有著重要的影響[3]。統(tǒng)一標準、高質量的生物樣本是研究數(shù)據真實性、可重復性、一致性以及整合數(shù)據和應用等的基礎,也是進行基礎和臨床大數(shù)據研究的重要保障。消化道微生態(tài)樣本可用于基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、培養(yǎng)組學、營養(yǎng)組學、微生態(tài)移植、轉化醫(yī)學等多方面的研究。目前尚缺乏消化道微生態(tài)樣本庫構建的標準和規(guī)范,制訂相關共識意見非常迫切和必要。

    本共識意見主要針對消化道微生態(tài)研究相關樣本的采集、制備、儲存等標準化達成共識,包括糞便、黏膜組織、血液、膽道相關樣本和口腔樣本。由臨床消化、倫理、消化道微生態(tài)研究、微生物組測序分析、生物樣本庫等多學科專家組成工作組,通過檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國期刊全文數(shù)據庫、中文科技期刊數(shù)據庫、萬方全文數(shù)據庫等,參考《生物標本采集技術規(guī)范及數(shù)據庫建立指南》、《中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準(試行)》和《ISBER生物樣本庫最佳實踐2018》,遵照我國原國家衛(wèi)生和計劃生育委員會《涉及人的生物醫(yī)學研究倫理審查辦法》(2016)、世界醫(yī)學會《赫爾辛基宣言》、國際醫(yī)學科學組織委員會(CIOMS)《涉及人類受試者的生物醫(yī)學研究國際倫理準則》等,形成共識意見草案,經工作組共同修改、討論而成。

    一、范圍與定義

    本共識意見主要包括消化道微生態(tài)生物樣本(糞便、消化道黏膜活檢組織、血液、膽道相關樣本、口腔樣本)的采集、制備、儲存等流程和臨床資源數(shù)據庫管理的基本方法。

    二、引文

    下列文件為本共識的必需文件。凡是注明日期的引用文件,僅注明日期的版本適用于本共識。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改單)適用于本共識。

    GB/T1.1-2009 標準化工作導則 第1部分:標準的結構和編寫

    GB/T20000 標準化工作指南

    GB/T20001 標準編寫規(guī)則

    GB/T12905-2000 條碼術語

    GB/T17172-1997417條碼

    GB/T18347-2001128條碼

    GB19489-2008 實驗室生物安全通用要求

    GB/T20269-2006 信息安全技術 信息系統(tǒng)安全管理要求

    GB/T22278-2008 良好實驗室規(guī)范原則

    CNAS-CL05-2009 實驗室生物安全認可準則

    WS/T224-2002 真空采血管及其添加劑

    世界衛(wèi)生組織 實驗室生物安全手冊 第三版

    三、術語與定義

    1. 樣本(sample):指在特定時間從參與者中采集的器官、組織、分泌物、排泄物等標本。

    2. 生物樣本庫(biobank):指接收、儲存、處理、分發(fā)樣本的實體。樣本庫包含其地理位置以及與其運營相關的所有活動。

    3. 質量控制(quality control):指為使樣本達到入庫標準所采取的操作技術和活動。

    4. 樣本編碼(sample coding):指根據編碼規(guī)則對樣本進行編號的過程。

    5. 實驗室生物安全(laboratory biosafety):指實驗室的生物安全條件和狀態(tài)不低于允許水平,并符合相關法規(guī)和標準對實驗室生物安全責任的要求,避免實驗室人員、來訪人員、社區(qū)和環(huán)境受到不可接受的損害。

    6. 質量管理體系(quality management system):為實現(xiàn)質量管理的方針目標、有效開展各項質量管理活動,需建立相應的管理體系,這一體系即為質量管理體系。相關文件包括:質量手冊、程序文件、標準操作規(guī)程和記錄。

    7. 信息管理系統(tǒng)(information management system):指用于管理人類樣本庫所儲存的生物樣本及其相關臨床、病理、隨訪、倫理審查、知情同意等信息的應用軟件和硬件。

    8. 知情同意(informed consent):獲得樣本捐贈者的知情同意是法律和倫理的重要原則和要求。指具有完全民事行為能力的個人,在充分獲取信息(包括研究性質、內容、風險、受益、持續(xù)時間等)并準確理解其內容后,作出是否參與研究的決定,此決定不受恐嚇、利誘、壓力或其他不當因素的影響。由于微生態(tài)樣本庫帶給個體的風險較小,建議采用廣泛同意模式,無需在未來研究中征求二次同意。

    9. 倫理審查委員會(Institutional Review Board/Ethical Review Committee):建立消化道微生態(tài)樣本庫以及開展相關研究應提交相關單位倫理審查委員會審查,經批準后方可開展研究。該委員會的組成和一切活動不應受臨床試驗組織和實施者的干擾或影響。

    四、消化道微生態(tài)標準化樣本庫設施、設備和安全管理

    1. 消化道微生態(tài)標準化樣本庫設施和設備:參考《中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會生物樣本庫標準(試行)》和《ISBER生物樣本庫最佳實踐2018》。

    2. 樣本庫人員安全:樣本庫操作人員日常要進行生物樣本的采集、分裝、入庫、出庫等操作,在此過程中面臨各種風險,因此需做好個人防護,包括穿工作服、帶口罩、手套、帽子等,同時對樣本操作中產生的廢棄物應按照醫(yī)療廢棄物管理條例進行處置。

    3. 樣本庫人員操作安全

    ①超低溫冰箱操作安全:超低溫冰箱是樣本庫的主要凍存設備之一,屬常規(guī)操作設備,樣本庫操作人員在進行超低溫冰箱操作時,必須佩戴手套,以防止凍傷。

    ②液氮操作安全:樣本庫操作人員在使用液氮罐或取用液氮進行樣本處理操作時,必須穿戴防護服,佩戴面罩或眼罩和手套,以防止凍傷。

    ③干冰操作安全:樣本庫操作人員在進行樣本采集、分裝和轉運過程中可能會使用干冰降溫,操作過程中需穿戴防護服、手套和口罩,盡量減少皮膚暴露。干冰操作應盡量在通風良好的環(huán)境中進行。

    4. 配備和維護有關設施、設備,保障樣本安全

    ①樣本庫安全設計:樣本庫設計時需考慮設施和設備的安全。存放樣本的樓層需做加固處理,需準確計算存儲設備滿載后的最大負重。為確保樣本存儲冰箱正常工作,樣本庫需設置備用應急電路和制冷系統(tǒng)。

    ②樣本庫設備定期維護:樣本庫超低溫冰箱等凍存設備需做好監(jiān)控記錄,定期維護保養(yǎng)。對于重要的樣本,建議在2臺冰箱中分開儲存,如有條件可進行異地備份儲存。

    ③樣本庫應急預案制訂:樣本庫應制訂應急處置預案尤其是超低溫冰箱的應急預案,由樣本庫主管確保其實施。預案中需明確遇突發(fā)情況時冰箱鑰匙的存放位置以及轉運樣本時所需的低溫設備如轉運盒、冰袋等,最大程度地降低樣本庫安全風險。

    5. 樣本庫數(shù)據安全

    ①樣本數(shù)據安全:樣本信息是樣本的重要組成部分,是關系樣本質量的重要衡量指標,因此樣本的信息安全至關重要。對于樣本采集過程中常規(guī)登記的信息,需指定專人負責登記記錄的保管;個人計算機或實驗室公用計算機錄入的樣本電子信息,需對涉及捐贈者信息的文件進行密碼保護和定期備份。

    ②樣本數(shù)據傳遞時的安全:在進行樣本共享和轉運時,會涉及樣本信息的傳遞,樣本庫管理人員需對捐贈者和患者的隱私信息進行相關處理,如使用樣本庫編號、去除捐贈者和患者的其他個人身份信息。盡量避免將數(shù)據存放在移動存儲設備中,必須通過U盤、移動硬盤或郵件傳遞時,需對數(shù)據進行加密處理,防止移動存儲設備丟失或數(shù)據被截獲造成的倫理風險。

    五、倫理審批與知情同意

    1. 倫理審批:研究方案、樣本采集方案、知情同意書等材料應經本單位倫理委員會批準同意后使用。此外,任何研究方案等文件的修改均須再次獲得倫理委員會批準才能實施,同時按照我國相關法規(guī)和倫理委員會的要求及時遞交其他跟蹤審查文件。倫理委員會有權監(jiān)督和跟蹤審查樣本采集、儲存、管理、分享、結果發(fā)布的全過程。

    2. 知情同意:人類消化道微生態(tài)樣本庫的工作人員應提前對風險與收益進行有效評估,確保樣本參與者或其近親屬對項目信息充分知情、理解相關風險、形成全面和準確的認識,自愿作出是否同意的決定,然后簽署知情同意書[4-5]。另需明確告知樣本提供者有拒絕的權利,不參與捐獻樣本不會影響其接受常規(guī)的醫(yī)療服務[4-5]。

    3. 隱私保護措施:研究人員、醫(yī)務人員應對樣本參與者的個人信息采取匿名化或編碼處理,確保參與者的個人信息不被泄露。若有充分理由要求參與者提供個人信息,需提請倫理委員會批準。違反法律規(guī)定導致隱私信息泄露,應依法追究民事責任、行政責任和刑事責任。

    4. 安全保護:研究人員或相關醫(yī)務人員在獲取樣本的過程中應盡量做到風險最小化,不增加樣本參與者的額外風險,避免為獲取樣本而置樣本參與者于危險之中。如樣本參與者發(fā)生不良反應,應采取緊急處理措施對其進行救治。

    六、消化道微生態(tài)樣本庫樣本采集和管理

    1. 樣本采集前處理:由于存在諸多宿主和環(huán)境因素會影響腸道微生物群[6],微生物組研究設計應考慮相關臨床數(shù)據的收集[7-8]。這些數(shù)據包括個人基本信息(性別、年齡、出生日期、居住地、居住環(huán)境、職業(yè)等)、醫(yī)療相關信息(既往史、抗菌藥物、化療藥物和其他相關藥物使用史、手術史、個人史等)、消化道微生態(tài)相關信息(飲食習慣、益生菌/益生元、食物補充劑、排便習慣、排便時間等)等[9]。應根據研究目標設計實用、高效的臨床數(shù)據收集項目。

    ①對于已知危害的樣本,根據世界衛(wèi)生組織《實驗室生物安全手冊》的規(guī)定,做好相應級別生物安全水平的個體防護,嚴格按照操作規(guī)范進行操作。

    ②對于未知危害、被認為存在潛在感染性的樣本,樣本采集工作人員應根據可能的感染風險做好相應的防護措施。

    ③應根據樣本類型和要求,盡可能提供潔凈無菌的環(huán)境用于樣本采集,避免樣本污染。

    ④樣本采集完成后應記錄樣本基本信息。

    樣本基本信息主要包括:樣本類型、采樣量、樣本編號等;黏膜組織樣本采集時應按照《臨床技術操作規(guī)范:病理學分冊》對樣本進行詳細、清晰的描述。應記錄樣本捐贈者的個人基本信息、臨床信息、隨訪信息等。個人基本信息主要包括:性別、年齡、身份證、居住地等;臨床信息主要包括:捐贈者基本健康信息、既往史、家族史等;對于遺傳疾病樣本,還應記錄捐贈者的家系信息如家族成員及其疾病史、成員婚配情況等。此外,捐贈者的飲食習慣、生活環(huán)境狀況等信息也需采集。

    ⑤采集工作人員應對整個采集過程進行記錄,其中包括但不限于知情同意書、調查問卷以及容器編號、采集地點、采集方法、采集日期、樣本采集各個步驟的時間和人員信息。

    ⑥樣本相關信息的記錄可以使用信息系統(tǒng)自帶的記錄功能,也可由工作人員填寫表格進行記錄。

    ⑦需考慮到生物樣本和相關資料將用于基因組學、代謝組學、蛋白質組學等研究,應兼顧其特殊性和可操作性。

    2. 消化道微生態(tài)樣本采集和保存

    ①糞便樣本采集和保存

    a. 糞便樣本的采集:采集容器需滿足無菌、密封要求。建議采用專用采集裝置[8]。采集過程中應避免尿液等污染。

    b. 糞便樣本的運輸:糞便標本應立即凍存于-80 ℃,此為新鮮糞便樣本保存的“金標準”[10-12]。糞便保存裝置內應保持厭氧環(huán)境[13-14],厭氧環(huán)境裝置不與糞便樣本直接接觸[3]。為保證檢測結果的準確性,建議采集后15 min內將糞便標本快速凍存或置于含保存液的密封容器內[15]。應盡量縮短糞便標本排出體外后暴露于室溫空氣中至凍存的時間,有研究提示不應超過2 h[3],但根據研究目的不同,即使2 h也可能會影響某些研究結果。

    運輸時間在24 h內,可以接受4 ℃冷藏運輸,但受溫度影響較大的微生物活性會降低甚至死亡,應根據研究目的確定是否采用[16]。運輸時間在24 h至1周內,應采用干冰運輸。條件受限不能采用低溫運輸時,可采用以下室溫保存方法臨時保存,如:RNAlater穩(wěn)定液[17]、95%乙醇[17]、糞便隱血檢測卡[17]、無水乙醇[18]、異硫氰酸胍溶液[15]、凍干法[18]。上述室溫保存方法在用于測序以外的目的,如培養(yǎng)組學、蛋白質組學、代謝組學時,應慎重考量該類保存方法對樣本培養(yǎng)和檢測結果的影響,權衡利弊后決定是否采用。此外,還可采用商業(yè)試劑盒,如OMNIgene·GUT等。

    c. 糞便樣本的分裝:糞便樣本應等分、足量分裝至凍存管等密封容器,超低溫(-80 ℃)保存,避免反復凍融,以免DNA降解[9]。分裝時為避免空氣對樣本的影響,應盡量選取糞便標本內部未接觸空氣的部分[16],每份標本質量不低于200 mg(去除食物殘渣后)。標本質量為25 mg時可能不影響DNA提取和測序,但應謹慎采用[10]。

    ②消化道黏膜內鏡活檢樣本和結腸灌洗樣本采集和保存

    a. 內鏡黏膜活檢樣本:根據研究目的采用選擇性活檢(最典型部位活檢)或定位性活檢(固定部位活檢)[19],為避免黏膜出血對活檢標本的影響,同一部位需采集多個標本時應更換活檢位置。采集時應避免黏膜組織被胃腸道內容物污染,BABD活檢鉗(Brisbane Aseptic Biopsy Device)能防止交叉污染[20]?;顧z標本應及時放入無菌凍存管,轉運至-80 ℃ 凍存[20]。

    b. 結腸灌洗樣本:結腸灌洗標本可以替代結腸內鏡活檢樣本用于消化道微生物研究[21]。結腸鏡檢查前應多飲水沖洗腸道,檢查前6 h行腸道準備,于乙狀結腸處吸取5 mL無糞塊污染的灌洗標本放入無菌凍存管,立即置于液氮或-80 ℃ 凍存。

    ③血液樣本采集和保存:細菌在人體外周血液各成分中的分布并不均勻[22],建議選擇全血標本。研究特定問題時,可根據研究目的選擇合適的標本,包括全血、血沉棕黃層、血清、血漿、血細胞等[22-23]。紅細胞中細菌豐度變化較大,不應棄用[22]。血液樣本中微生物豐度較低,需注意標本采集、核酸提取和擴增、測序的各個步驟均可能造成污染,應予避免。血液標本采集、處理時應嚴格遵守操作規(guī)范,預防污染。標本采集、處理所用物品應采用相應方法(紫外線照射、選擇性酶降解等)消除潛在的核酸污染。標本采集、處理步驟中應設置空白對照[22,24-32]。應通過靜脈穿刺采集,推薦使用肘正中靜脈等污染率低的部位。建議陰性對照樣本同時進行測序[32]。

    標本采集、處理后應直接凍存或加用RNAlater穩(wěn)定液后轉運至-80 ℃保存。為避免試劑、批次等因素對結果的影響,推薦集齊標本后再集中檢測[33],標本處理順序應隨機化。如為提取DNA后保存,應根據研究目的,采用相應方法提取DNA后,置于-20 ℃[34]或-80 ℃保存[23,31]。實驗室無相應條件時,不建議進行進一步處理。標本應在解凍后12 h內進行檢測,避免反復凍融。

    ④膽道相關樣本采集和保存

    a. 膽道黏膜樣本:外科腹腔鏡或開腹膽囊切除術后留取膽囊標本,以無菌水沖洗后及時凍存或放入RNAlater穩(wěn)定液中,轉運至-80 ℃凍存;或經內鏡逆行胰膽管造影(ERCP)途徑以活檢鉗取膽管活檢3~4塊,標準程序獲取的組織標本可被胃腸道內容物污染,應予注意,保存方法同前所述。

    b. 膽結石樣本:經外科手術、ERCP等途徑獲取膽結石標本,以無菌水反復沖洗表面膽汁等附著物,自然風干后置入無菌瓶內,-80 ℃凍存。

    c. 膽汁樣本:經ERCP膽總管插管成功后,建議更換造影管,使用新的造影管接近十二指腸乳頭開口,以無菌水沖洗(或以無菌水沖洗乳頭切開刀)后插入膽道,采用無菌空注射器抽吸膽汁5~10 mL;或膽系疾病在外科手術中以無菌注射針穿刺抽取膽汁。吸取的樣本立即放入無菌凍存管中,轉運至-80 ℃凍存。

    ⑤口腔微生物樣本采集和保存:應完整、詳細地記錄口腔病史和診療、檢查情況。取樣前30 min以清水將口腔內雜物漱凈,勿再進食、飲水、吸煙等。

    a. 唾液樣本:清水漱口后靜坐10 min。使用50 mL無菌離心管收集非刺激性唾液,唾液含于口中至少1 min,然后吐到無菌離心管或含DNA穩(wěn)定劑的樣品保存管中,此過程可重復多次,最后收集2~5 mL樣本。建議采用非刺激性唾液 采集法,如采集有困難,可考慮采用刺激性唾液采集法[35]。采集完成后將樣本置于冰上,2 h內轉運至-80 ℃凍存。含DNA穩(wěn)定劑的樣本短期內可常溫保存。

    b. 口腔拭子樣本:采用以無菌0.9% NaCl溶液或PBS潤濕的無菌拭子取樣。舌背部、腭扁桃體、咽喉部刮取5 s,口腔黏膜、上顎、角質化牙齦刮取10 s,避免觸碰其他部位。樣本刮取后立即封存于無菌凍存管置于冰上,2 h內轉運至-80 ℃ 凍存或置于含DNA穩(wěn)定劑的樣品保存管內保存。

    c. 牙菌斑樣本:分別記錄取樣部位:牙齒齦上或齦下牙菌斑。取樣前干燥取樣部位,使用口腔Gracey刮匙盡可能多地刮取牙菌斑(避免出血樣本),將刮匙浸入含緩沖液的無菌離心管中5 s,離心管置于冰上,2 h內轉運至-80 ℃凍存。

    七、消化道微生態(tài)樣本編碼

    1. 使用標簽、二維碼或條形碼的樣本編碼信息可包含樣本編號、疾病和樣本類型、采樣部位、采樣日期等。

    2. 樣本應有惟一的編號,但不能透露捐贈者信息。

    3. 樣本的儲存信息、研究數(shù)據等應能通過惟一的樣本編號關聯(lián)至同一樣本。

    八、消化道微生態(tài)臨床數(shù)據庫與信息管理庫

    1. 樣本庫應有統(tǒng)一、完整的信息系統(tǒng)或數(shù)據庫,用于樣本信息的記錄和儲存。

    2. 所有樣本信息(采集、處理、儲存、使用信息、捐贈者相關信息)和臨床信息均應記錄于信息系統(tǒng)。臨床資料應基于規(guī)范化的臨床診療。臨床治療過程記錄和隨訪資料應完整。

    3. 樣本庫信息管理系統(tǒng)宜與其他相關數(shù)據系統(tǒng)(如樣本采集醫(yī)院的臨床數(shù)據管理系統(tǒng)、其他樣本庫信息管理系統(tǒng))兼容或關聯(lián),以便共享樣本信息和數(shù)據。

    4. 樣本庫數(shù)據管理系統(tǒng)應根據不同工作人員的職責設置不同管理和訪問權限,以確保信息安全。

    5. 樣本庫信息管理系統(tǒng)應滿足樣本追蹤和檢索的需求。

    6. 樣本庫信息管理系統(tǒng)應建立安全保障,防止黑客入侵、計算機病毒傳播、數(shù)據損壞等意外情況。

    7. 應根據實際需求制訂備份周期,按周期對樣本信息和數(shù)據進行備份,以應對信息和數(shù)據的意外損壞,并及時進行異地備份和歷史備份。

    九、附件

    1. 生物樣本庫與臨床數(shù)據管理系統(tǒng)

    2. 生物樣本庫與臨床數(shù)據管理路線圖

    3. 生物樣本信息數(shù)據庫

    專家組單位和成員(按單位和姓氏拼音排序):

    北京大學口腔醫(yī)學院中心實驗室(陳峰)

    北京諾禾致源科技股份有限公司(李旭歡,劉文彬,麥茵)

    大連醫(yī)科大學微生態(tài)教研室(袁杰力)

    河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院兒科(張琳)

    南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化內科(陳燁)

    上海嘉會國際醫(yī)院消化內科(夏璐)

    上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內科(房靜遠)

    上海芯超生物科技有限公司(華友佳)

    上海張江生物銀行(張可浩)

    深圳華大生命科學研究院(李曉平,肖亮,鄒遠強)

    深圳譜元科技有限公司(李少川,覃俊杰,楊仁濤)

    生物芯片上海國家工程研究中心(郜恒駿)

    同濟大學醫(yī)學院消化疾病研究所(何承志)

    廈門大學醫(yī)學院生命倫理研究中心(馬永慧)

    香港Asia Microbiota Bank(Jon Chang張建誠)

    鄭州大學第五附屬醫(yī)院消化內科(鄭鵬遠)

    中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所(楊瑞馥)

    中國人民解放軍總醫(yī)院臨床生物樣本庫(趙秀梅)

    中國人民解放軍總醫(yī)院消化內科(彭麗華,史以超,王子愷,楊云生)

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