生防菌對(duì)杧果主要病害病原菌室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

張賀，楊石有，汪熊夢(mèng)琦，劉曉妹，漆艷香，蒲金基

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；2.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228)

杧果種植過(guò)程中常遭受多種病害，如刺盤(pán)孢屬Colletotrichumspp.真菌引起的杧果炭疽病，鏈格孢屬Alternariaspp.真菌引起的杧果鏈格孢葉斑病，以及由鐮孢屬Fusariumspp.真菌引起的且在金沙江干熱河谷暴發(fā)成災(zāi)的杧果畸形病[1-4]，這些病害不同程度地威脅著杧果健康生長(zhǎng)[5]。施用農(nóng)藥是防治病害的重要措施，隨著杧果種植面積逐年擴(kuò)大，病害防治難度加大，化學(xué)農(nóng)藥使用量總體呈上升趨勢(shì)。過(guò)量使用農(nóng)藥不僅增加生產(chǎn)成本，也影響杧果質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)境安全。實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥減量控害，是當(dāng)前杧果病害防治的難題之一。

以菌治菌是植物病害防治的重要方法之一，前人在此方面的研究也取得了積極進(jìn)展[6-9]。為篩選對(duì)杧果重要病害有良好防效的生防菌，作者用前期得到的生防菌和市售的生防菌劑，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定其對(duì)刺盤(pán)孢屬、鏈格孢屬、鐮孢屬等27株病菌菌株的室內(nèi)抑菌效果，以期初步獲得對(duì)杧果單一病害或多種病害均有良好防效的生防菌，為杧果病害的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病菌菌株 刺盤(pán)孢屬8株，編號(hào)為2K120cg、2K345cg、A1、bca、Lcg1、mac9、Mcg、Tai；鏈格孢屬9株，菌株編號(hào)為A108、A157、A406、A452、A456、A466、A483-1、A92、A93；鐮孢屬10株，菌株編號(hào)為FM4、MMD1、MMD12、MMD14、MMD17、MMD20、MMD27、MMD29、MMD30、MMD4。27株病菌菌株由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)病害課題組提供，每個(gè)屬的病菌菌株均分離自病害發(fā)生嚴(yán)重的海南省三亞市、樂(lè)東縣、東方市，云南省保山市，廣西壯族自治區(qū)百色市，四川省攀枝花市等杧果主產(chǎn)區(qū)。

1.1.2 供試生防菌劑 枯草芽孢桿菌S1，山東省梁山縣陽(yáng)光生物工程研究所；枯草芽孢桿菌S2，北海群林生物工程有限公司；枯草芽孢桿菌S3，云南星耀生物制品廠(chǎng)；嗜冷·枯草·納豆芽孢桿菌S4，山東寶來(lái)利生物工程股份有限公司；側(cè)孢芽孢桿菌S5，河南省沃寶生物科技有限公司；巨大芽孢桿菌S6，河南省沃寶生物科技有限公司；地衣芽孢桿菌S7，臨沂十七狼飼料有限公司；蠟質(zhì)芽孢桿菌S8，山東泰洛藥液有限公司；枯草·納豆·地衣芽孢桿菌·硝化細(xì)菌S9，西安富祺生物科技有限公司；市售的生防菌劑地衣芽孢桿菌S10，山西凱盛肥業(yè)集團(tuán)有限公司；解淀粉芽孢桿菌S11，山西凱盛肥業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.1.3 供試生防菌 生防酵母菌JM由實(shí)驗(yàn)室篩選而得；枯草芽孢桿菌5a-9、6a-3、6c-5、6c-5、FCK、B1和Z10由海南大學(xué)劉曉妹教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病菌培養(yǎng)和生防菌菌懸液制備 刺盤(pán)孢屬、鏈格孢屬和鐮孢屬病菌接種在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d之后，用無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打直徑5 mm菌餅，用于接種LB平板(直徑9 cm)的正中央備用。

將市售11種生防菌劑依有效成分含量用LB培養(yǎng)液系列稀釋至濃度為2×107個(gè)/mL的菌懸液，6種生防芽孢桿菌(編號(hào)為5a-9、6a-3、6c-5、FCK、B1、Z10)和1株生防酵母菌JM接種于LB培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r/min 恒溫?fù)u培24 h后，系列稀釋法配置成菌體濃度為2×107個(gè)/mL的菌懸液備用。

1.2.2 生防菌抑菌作用檢測(cè) 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法。LB平板中央接種靶標(biāo)病菌，同時(shí)在其夾角呈90°的四周、間距靶標(biāo)病菌3.0 cm處接種2.5 μL生防菌液，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后測(cè)定病菌菌落直徑、抑菌帶寬度，并根據(jù)尹敬芳 等[10]人的方法計(jì)算生長(zhǎng)抑菌率，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2003統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、計(jì)算生長(zhǎng)抑菌率，SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)運(yùn)用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，運(yùn)用HemI 1.0.3.3軟件以抑菌率繪制直觀(guān)可視化的熱圖，展示不同生防菌對(duì)不同病菌的抑菌效果，每個(gè)小方格表示一個(gè)生防菌對(duì)一個(gè)病菌菌株的抑菌效果，用行表示不同病菌、用列表示不同生防菌，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低，綜合分析不同病菌與不同生防菌之間抑菌效果差異[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌對(duì)刺盤(pán)孢屬病菌菌絲生長(zhǎng)的拮抗作用 供試的生防菌對(duì)刺盤(pán)孢屬的8個(gè)菌株有明顯的抑菌效果，平均抑菌率為17.27%～36.77%。生防菌劑枯草芽孢桿菌S3顯著強(qiáng)于其他的生防菌，其平均抑菌率為36.77%；其次為巨大芽孢桿菌S6和枯草芽孢桿菌FCK，平均抑菌率分別為27.59%和25.96%，二者差異不顯著(表1)。

表1 生防菌對(duì)木亡果主要病原菌抑菌率 %

注：根據(jù)Duncan’s多重比較，同列不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

生防菌劑枯草芽孢桿菌S3對(duì)供試的8個(gè)菌株均有較強(qiáng)的抑菌效果，其中對(duì)Mcg菌株的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌率53.79%，抑菌帶1.03 cm；多個(gè)生防菌菌株對(duì)bca菌株有較強(qiáng)抑菌效果(圖1)。

注：以抑菌率作熱圖，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低。圖1 生防菌對(duì)刺盤(pán)孢屬病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率

2.2 生防菌對(duì)鏈格孢屬病菌菌絲生長(zhǎng)的拮抗作用 供試的生防菌對(duì)鏈格孢屬的9個(gè)菌株有明顯的抑菌效果，平均抑菌率為9.77%～28.63%。其中枯草芽孢桿菌6a-3效果最好，平均抑菌率28.63%；其次為枯草芽孢桿菌S3和FCK，平均抑菌率分別為24.55%和24.48%，二者差異不顯著(表1)。病菌株A483-1對(duì)供試的11種市售生防菌劑和7種前期篩選得到的生防菌均有很強(qiáng)耐受性，部分生防菌株對(duì)其還有促生長(zhǎng)作用；枯草芽孢桿菌B1對(duì)病菌菌株A108抑菌效果最強(qiáng)，抑菌率達(dá)50.64%，抑菌帶1.60 cm(圖2)。

注：以抑菌率作熱圖，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低。圖2 生防菌對(duì)鏈格孢屬病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率

2.3 生防菌對(duì)鐮孢屬病菌菌絲生長(zhǎng)的拮抗作用 供試的生防菌對(duì)鐮孢屬的10個(gè)菌株抑菌效果明顯，平均抑菌率為15.35%～50.95%?？莶菅挎邨U菌S3顯著強(qiáng)于其他的生防菌，平均抑菌率50.95%；其次為枯草芽孢桿菌FCK抑菌率為40.37%；蠟質(zhì)芽孢桿菌S8抑菌效果較差(表1)?？莶菅挎邨U菌S3對(duì)9個(gè)菌株有很好的抑菌效果，抑菌率為45.69%～60.07%、平均抑菌帶寬為1.10 cm；病菌MMD1菌株對(duì)枯草芽孢桿菌S3、枯草·納豆·地衣芽孢桿菌·硝化細(xì)菌S9、枯草芽孢桿菌5a-9、6c-5、FCK、B1和Z10較敏感，而病菌MMD29菌株則對(duì)多個(gè)生防菌株的敏感性較差(圖3)。

注：以抑菌率作熱圖，紅色表示抑菌率高，綠色表示抑菌率低。圖3 生防菌對(duì)鐮孢屬病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率

3 結(jié)論與討論

供試的7株生防菌和11種市售生防菌劑對(duì)杧果上分離的27株病菌的抑菌結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌S3對(duì)刺盤(pán)孢屬、鏈格孢屬、鐮孢屬病菌都有明顯的抑菌效果，尤其對(duì)鐮孢屬病菌的抑菌效果最好，平均抑菌率超過(guò)50%，而對(duì)鏈格孢屬病菌的抑菌效果則略次。與市售的商品化生防菌劑相比，本次篩選的枯草芽孢桿菌FCK菌株的抑菌效果與生防菌劑S3有較好抑菌效果，具有開(kāi)發(fā)成生防菌劑的潛力，可用于杧果病害的生物防治。

芽孢桿菌Bacillusspp.是廣泛存在于自然界中重要的生物防治微生物資源，芽孢桿菌對(duì)植物病原真菌的拮抗作用已被前人證實(shí)[8]，是杧果病害綠色防控技術(shù)中的重要生防菌。平板對(duì)峙培養(yǎng)中2種菌落在培養(yǎng)基上競(jìng)爭(zhēng)能力的高低，以最終形成的抑菌圈直徑大小為標(biāo)準(zhǔn)，從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，其與病原菌間主要有營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制病菌菌絲的生長(zhǎng)兩種情況，這與關(guān)一鳴 等[12]的研究結(jié)果較為相似。芽孢桿菌的生防機(jī)制主要有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、抗菌物質(zhì)分泌及溶菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等[13]。部分供試病菌的菌絲受生防菌的影響明顯膨大、畸形，阻礙了菌絲的正常生長(zhǎng)。陳莉[14]認(rèn)為芽孢桿菌能夠分泌多肽，從而起到抑菌作用；韓玲 等[15]在枯草芽孢桿菌菌液對(duì)百合枯萎病的防治的研究過(guò)程中認(rèn)為芽孢桿菌能產(chǎn)生制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，對(duì)作物的多種真菌病害有防治作用。生防菌劑芽孢桿菌類(lèi)枯草芽孢桿菌S3、巨大芽孢桿菌S6、枯草芽孢桿菌FCK和酵母菌菌株JM在本試驗(yàn)中對(duì)多種杧果上病菌的抑菌率較高，與康浩 等[16]、劉曉妹 等[17]研究結(jié)果相似，可用于下一步的田間病害防治試驗(yàn)。

試驗(yàn)中同一種病害的不同病菌菌株對(duì)生防菌的耐受性差別明顯，有些菌株對(duì)生防菌劑十分敏感，而有些菌株則對(duì)生防菌劑耐性較高，不同生防菌劑的抑菌效果也差異明顯。因此在開(kāi)展生防菌篩選時(shí)應(yīng)考慮到兩個(gè)方面，一方面是在不同病害發(fā)生區(qū)域內(nèi)選取多個(gè)菌株用于生防菌的篩選與鑒定，另一方面是選取多種無(wú)相互拮抗的生防菌，復(fù)配成多種生防菌劑的混合液進(jìn)行篩選，再結(jié)合田間試驗(yàn)獲得高效的、廣譜、易于培養(yǎng)的生防菌劑，應(yīng)用于病害防治，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，延緩病菌的抗藥性產(chǎn)生，降低化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的威脅，從而保證杧果的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。