修復(fù)牙周缺損的細(xì)胞膜片構(gòu)建方法新進(jìn)展

馮頂麗，卓麗丹，蘆 笛，傅 營(yíng) 綜述 郭紅延 審校

牙周缺損常見(jiàn)于牙周病和牙周創(chuàng)傷，已經(jīng)開(kāi)發(fā)的多種材料如骨移植材料、屏障膜和蛋白質(zhì)產(chǎn)品等，可用于治療牙周缺損，但難以再生完整的牙周組織。近來(lái)，隨著組織工程在修復(fù)缺損組織中的應(yīng)用，細(xì)胞療法被引入牙周缺損修復(fù)。目前已經(jīng)證明在機(jī)體許多成熟組織器官中存在成體干細(xì)胞[1]。2004年，Seo等[2]首次從成年人健康的牙周組織中分離培養(yǎng)并鑒定了牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)。在某些特定條件誘導(dǎo)下，該類(lèi)細(xì)胞可“橫向分化”成為其他組織的功能細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)缺損牙周組織的修復(fù)和再生。

再生醫(yī)學(xué)的早期臨床試驗(yàn)是將種子細(xì)胞接種到生物降解的支架中。近幾十年來(lái)，開(kāi)發(fā)了一種新的細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法，即細(xì)胞膜片技術(shù)[3，4]，其無(wú)需支架，具有巨大的細(xì)胞負(fù)載能力，可改善干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生。筆者就近年來(lái)修復(fù)牙周缺損細(xì)胞膜片的制備及獲取的不同方法進(jìn)行綜述。

1 種子細(xì)胞

1.1 牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞膜片 PDLSC是牙周組織工程的主要種子細(xì)胞之一，將PDLSC從牙周組織中提取并進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)期，根據(jù)需要將細(xì)胞接種于不同材質(zhì)的孔板內(nèi)，然后用特殊的的培養(yǎng)液加以誘導(dǎo)，制備細(xì)胞膜片，一般在21 d左右細(xì)胞膜片會(huì)逐漸成熟，出現(xiàn)邊緣卷曲現(xiàn)象，此時(shí)獲取細(xì)胞膜片可用于牙周組織缺損的修復(fù)[5,6]。

單一細(xì)胞膜片制備相對(duì)方便快捷，但存在諸如細(xì)胞死亡、骨向分化程度差、血管化不充分、再生結(jié)構(gòu)單一和不完整性等問(wèn)題 ，不能很好地再生包含軟組織和硬組織的復(fù)雜牙周組織。共培養(yǎng)策略通過(guò)有效地利用細(xì)胞間的相互影響，相互作用可能解決上述問(wèn)題。細(xì)胞分泌的各種因子會(huì)協(xié)調(diào)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基之間的相互作用并調(diào)節(jié)新再生組織的結(jié)構(gòu)和功能。因此，通過(guò)種子細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的形成和保存能力有益于牙周組織的完全再生。

1.2 共培養(yǎng)MSC與PDLSC構(gòu)建細(xì)胞膜片

1.2.1 PDLSC和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng) PDLSC和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)由于其強(qiáng)的增殖和分化成牙周組織的能力而在牙周組織的再生工程中受到廣泛的關(guān)注。共培養(yǎng)這兩種類(lèi)型的干細(xì)胞，在生理?xiàng)l件下相互作用，同時(shí)形成包含有利于組織再生的多種因子的細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)建細(xì)胞膜片。

共培養(yǎng)PDLSCs和BMMSCs構(gòu)建的細(xì)胞片與單用PDLSCs或BMMSC的細(xì)胞膜片相比，表達(dá)更高水平的骨和ECM相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的復(fù)合組織結(jié)構(gòu)也更類(lèi)似于體內(nèi)天然牙周組織[7]。Xie等[8]將人PDLSCs、BMMSC共培養(yǎng)，并通過(guò)骨誘導(dǎo)的陶瓷牛骨粉末作為混合型干細(xì)胞膜片。當(dāng)PDLSCs與BMMSC共培養(yǎng)時(shí)，ALP活性和增殖動(dòng)力學(xué)上調(diào)，同時(shí)膠原蛋白Ⅰ，骨鈣素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)也上調(diào)。在體內(nèi)，混合型hPDLSC團(tuán)可以模仿牙周膜韌帶的微環(huán)境，促進(jìn)牙骨質(zhì)/牙周韌帶樣組織再生中新生血管形成。

1.2.2 PDLSC和牙囊干細(xì)胞共培養(yǎng) 牙囊細(xì)胞被認(rèn)為包含可形成牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨的牙周膜前體細(xì)胞，這些前體細(xì)胞具有很強(qiáng)的干細(xì)胞特性，統(tǒng)稱(chēng)為牙囊干細(xì)胞(dental follicle stem cells，DFSCs)。

李欣等[9]使用比格犬DFSC、PDLSC和混合細(xì)胞分別制備細(xì)胞膜片。然后，三種類(lèi)型的細(xì)胞膜片以同種異體方式移植到具有三壁牙周缺陷的比格犬牙根表面，骨缺損填充羥磷灰石-磷酸鈣(HA-TCP)，設(shè)置了填充HA-TCP的對(duì)照組。牙周病臨床檢查，組織學(xué)和病理分析表明，混合細(xì)胞膜片組的牙周愈合優(yōu)于對(duì)照組，相較于其他單細(xì)胞組能獲得完整的牙骨質(zhì)、牙槽骨及規(guī)則的牙周膜樣結(jié)構(gòu)。王麗穎等[10]提出將人的PDLSC及DFSC混合共同培養(yǎng)，制成細(xì)胞膜片。顯示DFCS可增強(qiáng)PDLSC的自我更新和多向分化的能力并為其提供良好的微環(huán)境，促進(jìn)牙周組織再生。將其與人DFCs、PDLSCs兩種單一細(xì)胞膜片進(jìn)行比較，結(jié)果顯示混合細(xì)胞膜片細(xì)胞層數(shù)更多，基質(zhì)分泌量更大。這一特質(zhì)為其提供了更好的彈性和更穩(wěn)定的機(jī)械性能，增加了其臨修復(fù)牙周缺損的可操作性。

1.2.3 PDLSC和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng) Panduwawala等[11]將PDLSC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)或兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)制備細(xì)胞膜片。將細(xì)胞膜片以三種不同的組合包裹在人牙根周?chē)?，并皮下植入免疫缺陷小鼠。組織學(xué)評(píng)價(jià)顯示，在植入2、4和8周后，與對(duì)照相比，在實(shí)驗(yàn)組中植入的牙根周?chē)^察到牙周韌帶樣組織排列。此外，在含有HUVEC組的牙周腔內(nèi)觀察到血管腔。在第4周和第8周的實(shí)驗(yàn)組中，牙周膜韌帶再生，牙骨質(zhì)生成和成骨都比較明顯。此外，研究表明HUVEC的存在可以促進(jìn)牙周細(xì)胞的遷移[12]。單獨(dú)的PDLSCs、HUVECs和各種比例的兩種細(xì)胞(1∶1，2∶1，5∶1和1∶5)培養(yǎng)獲得細(xì)胞膜片，結(jié)果顯示在1：1和5：1共培養(yǎng)組中觀察到更高的堿性磷酸酶(ALP)基因表達(dá)，這與ALP蛋白定量一致。與單細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞片相比，表現(xiàn)出顯著高水平的骨/牙源性標(biāo)記與初始血管形成[13]。

功能組織再生強(qiáng)調(diào)了有利的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境和新血管的形成。在研究中，將PDLSCs和其他干細(xì)胞混合培養(yǎng)重建有利的再生微環(huán)境，有助于復(fù)雜牙周組織的再生。

2 誘導(dǎo)環(huán)境對(duì)構(gòu)建細(xì)胞膜片的影響

2.1 培養(yǎng)基中添加維生素C 使用加入不同濃度的維生素C(0、10、20、50 mg/ml)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)構(gòu)建細(xì)胞膜片。研究顯示維生素C誘導(dǎo)BMSCs以劑量依賴(lài)的方式形成細(xì)胞膜片，培養(yǎng)基中維生素C的濃度為50 mg/ml時(shí)細(xì)胞膜片形成最快。與對(duì)照組相比，能產(chǎn)生和保存較高量的膠原和其他ECM成分。此外，維生素C在提高BMSCs的增殖能力的同時(shí)卻不影響膜片的成骨分化能力[14]。Fl Wei等[15]以不同濃度的維生素C構(gòu)建人PDLSC膜片，結(jié)果顯示維生素C可誘導(dǎo)PDLSCs構(gòu)建高質(zhì)量的細(xì)胞膜片。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)維生素C能夠誘導(dǎo)PDLSCs中的端粒酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原，纖連蛋白和整合素β1，干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4，Sox2和Nanog，以及成骨標(biāo)記物RUNX2，ALP，OCN的上調(diào)表達(dá)。該誘導(dǎo)方法與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，被誘導(dǎo)的細(xì)胞具有更強(qiáng)的生物活性，保留了細(xì)胞間緊密聯(lián)系的ECM，而且保留了接近質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)微絲和外吐小囊泡，相比更易獲得高質(zhì)量的細(xì)胞膜片。將這兩種方法制備的細(xì)胞片植入裸鼠體內(nèi)后，經(jīng)維生素C制備的細(xì)胞膜片可分化形成更多的成牙質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，最終形成更加規(guī)則的骨/牙骨質(zhì)樣基質(zhì)。在體內(nèi)，利用維生素C誘導(dǎo)PDLSCs產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建膜片后植入比格犬的牙周缺損模型，6周后發(fā)現(xiàn)有牙骨質(zhì)/牙周韌帶樣組織形成[16]。

2.2 培養(yǎng)液對(duì)PDLSC膜片生物學(xué)特性的影響 有研究者取得大鼠發(fā)育期根端復(fù)合體結(jié)構(gòu)，體外分離并培養(yǎng)細(xì)胞，取得上清，制備DAC條件培養(yǎng)液。利用DAC條件培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)液分別誘導(dǎo)PDLSCs膜片。結(jié)果表明，與成骨誘導(dǎo)相比，DAC誘導(dǎo)體系更適合PDLSCs膜片的形成，膜片含有豐富的短棒狀細(xì)胞和大量細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞膜片periastin和堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)豐富，體外成骨基因表達(dá)更高[17]。2011年，有研究發(fā)現(xiàn)鼠根端乳頭條件培養(yǎng)基(APTG-CM)可促進(jìn)PDLCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)化的功能，APTG-CM有利于牙周組織再生[18]。2017年，有研究采用骨髓間充質(zhì)細(xì)胞條件誘導(dǎo)液(BMMSCs-CM)與根端牙胚條件誘導(dǎo)液(APTG-CM)分別誘導(dǎo)PDLSCs膜片4、7、10 d。10 d后，BMSCs-CM組的克隆形成率(37%)大于APTG-CM組的克隆形成率(24%)，且BMMSCs誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后的PDLSCs膜片可產(chǎn)生更豐富的細(xì)胞外基質(zhì)。掃描電鏡可見(jiàn)BMMSCs組細(xì)胞膜片表面有礦化沉積和膠原組織形成，APTG-CM組細(xì)胞膜片表面有大量膠原纖維狀組織形成。可見(jiàn)，BMMSCs誘導(dǎo)液更有利于牙周組織再生[19]。

3 細(xì)胞膜片在材料表面的分離技術(shù)

胰酶消化法是目前最常用的細(xì)胞獲取的方法，但細(xì)胞膜蛋白損傷大，無(wú)法保留完整的細(xì)胞間連接和細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞的早期凋亡率高，體內(nèi)移植后細(xì)胞保持活力的時(shí)間短[20]。與此方法相比，其他的分離技術(shù)顯示了各自的優(yōu)勢(shì)。

3.1 溫敏材料 溫度敏感性材料N-異丙基丙烯酰胺[PNIPAAm]的研發(fā)與利用，為胰酶消化存在的上述問(wèn)題提供了新的解決方法。PNIPAAm材料制備的溫敏性培養(yǎng)皿，用于細(xì)胞的培養(yǎng)和非機(jī)械性降溫分離獲得細(xì)胞片[21]，無(wú)需酶消化即可獲得完整的細(xì)胞膜片。其主要原理是PNIPAAm會(huì)隨溫度的改變呈現(xiàn)不同的整體構(gòu)型和表面潤(rùn)濕性。37 ℃時(shí)，其表面呈弱疏水性，適于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)；當(dāng)溫度低于32 ℃時(shí)，表面呈親水性并發(fā)生溶脹，從而使細(xì)胞與培養(yǎng)皿分離。因此，培養(yǎng)的細(xì)胞在低溫下容易從這樣的溫度反應(yīng)表面完整地分離。然而這種由PNIPAAm材料包被的溫度培養(yǎng)皿較長(zhǎng)的冷卻時(shí)間會(huì)影響細(xì)胞功能、PNIPAAm溶解有細(xì)胞毒性、PNIPAAm材料的厚度會(huì)影響細(xì)胞黏附等，因此PNIPAAm聚合物材料進(jìn)一步改進(jìn)成為研究熱點(diǎn)。

2009年，WANG等[22]通過(guò)將丙烯酸衍生的殼聚糖(CSA)和N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)共聚合成溫敏性聚(PNIPAAm-co-CSA)水凝膠。當(dāng)培養(yǎng)溫度從37 ℃降低至20 ℃時(shí)，CS鏈具有良好的親水性和吸濕性。L929細(xì)胞黏附和脫離的研究表明，在37℃時(shí)PNIPAAm-co-CSA水凝膠表面上的細(xì)胞黏附和擴(kuò)散比PIPAAm水凝膠的表面具有更加優(yōu)異的細(xì)胞親和力與更快的細(xì)胞片脫離。另外也有很多學(xué)者對(duì)此材料進(jìn)行了改進(jìn)[23]，通過(guò)各種方法修飾PNIPAAm和PNIPAAm衍生物研制溫度反應(yīng)性細(xì)胞培養(yǎng)表面，極大地改善了細(xì)胞膜片的獲取。

3.2 聚電解質(zhì)涂層技術(shù) 聚電解質(zhì)改性的表面，也可用于控制細(xì)胞片的釋放。靜電作用并在電化學(xué)極化后從導(dǎo)電基底解吸，可使聚電解質(zhì)吸附到相反電荷的表面。基于這種機(jī)制，開(kāi)發(fā)了用于收集細(xì)胞片的電響應(yīng)系統(tǒng)。研究表明，在金屬氧化物上的聚(1-賴(lài)氨酸)(PLL)接枝的聚(乙二醇)(PEG)單層可以通過(guò)基底的電化學(xué)極化解吸。利用該原理，可通過(guò)施加短的正電位從銦錫氧化物(ITO)中解吸PLL-g-PEG/PEG-RGD單層。換言之，吸附的PLL-g-PEG/PEG-RGD單層成為細(xì)胞附著到金屬氧化物底物的媒介。該單層解吸時(shí)，細(xì)胞會(huì)失去其附著點(diǎn)而發(fā)生分離[24]。

Zahn等[25]利用離子溶解技術(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞膜片分離。首先合成聚電解質(zhì)多層膜，接種成肌細(xì)胞膜片于該多層膜上，這種聚電解質(zhì)多層膜由底層的多聚賴(lài)氨酸/透明質(zhì)酸和上層的纖連蛋白組成，在培養(yǎng)基中加入多價(jià)陽(yáng)離子-亞鐵氰化物以分解破壞聚電解質(zhì)多層膜，從而引起細(xì)胞膜片迅速地從培養(yǎng)皿中脫離。

3.3 其他方法 其他的細(xì)胞膜片分離技術(shù)也在不斷出現(xiàn)，為實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量細(xì)胞膜片的大量獲取奠定了基礎(chǔ)。例如Ito等[26]利用磁力使角質(zhì)形成細(xì)胞附著和釋放。磁鐵礦標(biāo)記的角質(zhì)形成細(xì)胞在超低附著板上培養(yǎng)，有磁體放置在平板下方時(shí)，細(xì)胞會(huì)均勻地散布在表面，沒(méi)有磁體放置時(shí)細(xì)胞將無(wú)法擴(kuò)散。 為了分離細(xì)胞片，將磁體從平板下面移除，且將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放置在磁體的表面。移動(dòng)磁鐵到細(xì)胞上面，磁力導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞片黏附在磁體表面的PVDF膜上。之后，細(xì)胞可隨著PVDF膜從磁體表面分離。Qiu等[27]在云母片表面涂抹 A6K溶液，接種成骨細(xì)胞在該表面層。當(dāng)細(xì)胞膜片成形且邊緣卷起時(shí)，無(wú)須改變溫度，即可用鑷子將細(xì)胞膜片迅速而完整地從表面分離，與其他分離技術(shù)相比，這種分離方式更為簡(jiǎn)便，且因沒(méi)有添加其他毒副材料，具有更高的生物安全性。

綜上所述，包含軟組織和硬組織的功能性牙周樣組織的再生是牙周組織的組織工程修復(fù)缺損的最終目標(biāo)，同時(shí)也給科研與臨床應(yīng)用帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。與單細(xì)胞移植方法相比，細(xì)胞膜片的細(xì)胞密度和移植效率更高，可高效再生修復(fù)牙周缺損，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。目前細(xì)胞膜片在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究較為廣泛。雖然其牙周組織再生的效果是肯定的，然而，細(xì)胞膜片在牙周再生中的應(yīng)用還處于初級(jí)階段，仍需要不斷的深入研究與改進(jìn)。

[1] Carreira A C, Zambuzzi W F, Rossi M C,etal.Bone Morphogenetic Proteins: Promising Molecules for Bone Healing, Bioengineering, and Regenerative Medicine.[J].J Vitamins & Hormones, 2015, 99:293-322.

[2] Seo B M, Miura M, Gronthos S,etal.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].J Lancet, 2004,364(9429):149-155.

[3] Sakaguchi K, Shimizu T, Okano T.Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering[J].J Control Release, 2015, 205:83-88.

[4] Itaba N, Matsumi Y, Okinaka K,etal.Human mesenchymal stem cell-engineered hepatic cell sheets accelerate liver regeneration in mice[J].J Sci Rep, 2015, 5:16169.

[5] Hu J, Cao Y, Xie Y,etal.Periodontal regeneration in swine after cell injection and cell sheet transplantation of human dental pulp stem cells following good manufacturing practice[J].J Stem Cell Res Ther, 2016,7(1):130.

[6] 李 敏, 王 瑤, 于華龍,等.人牙周韌帶細(xì)胞-聚羥基乙酸支架復(fù)合體修復(fù)牙周組織缺損[J].中國(guó)組織工程研究, 2016, 20(12):1718-1724.

[7] Zhang H, Liu S, Zhu B,etal.Composite cell sheet for periodontal regeneration: crosstalk between different types of MSCs in cell sheet facilitates complex periodontal-like tissue regeneration[J].J Stem Cell Res Ther, 2016,7(1):168.

[8] Xie H, Liu H.A novel mixed-type stem cell pellet for cementum/periodontal ligament-like complex[J].J Periodontol, 2012,83(6):805-815.

[9] 李 欣, 金作林, 吳 瓊, 等.應(yīng)用牙周膜干細(xì)胞—牙囊干細(xì)胞復(fù)合細(xì)胞膜片同種異體移植修復(fù)比格犬牙周組織缺損的研究[J].口腔疾病防治, 2016，9(4):204-210.

[10] 王麗穎, 金作林, 宋 揚(yáng), 等.構(gòu)建一種新型牙周膜牙囊復(fù)合細(xì)胞膜片的研究[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2013，17(4):195-199.

[11] Panduwawala C P, Zhan X, Dissanayaka W L,etal.In vivo periodontal tissue regeneration by periodontal ligament stem cells and endothelial cells in three‐dimensional cell sheet constructs[J].J Periodontal Res，2017 ,52(3):408-418.

[12] Din J, Yin Y Z.The effect of vascular endothelial cells on the proliferation of periodontal ligament cells and gingival fibroblasts[J].J Shanghai J stomato, 2013, 22(5):518.

[13] Pandula P K, Samaranayake L P, Jin L J,etal.Human umbilical vein endothelial cells synergize osteo/odontogenic differentiation of periodontal ligament stem cells in 3D cell sheets[J].J Periodontal Res, 2014,49(3):299-306.

[14] Guo P, Zeng J J, Zhou N.A novel experimental study on the fabrication and biological characteristics of canine bone marrow mesenchymal stem cells sheet using vitamin C[J].J Scanning, 2015,37(1):42-48.

[15] Wei F, Qu C, Song T,etal.Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity[J].J Cell Physiol, 2012,227(9):3216-3224.

[16] Iwata T, Yamato M, Tsuchioka H,etal.Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].J Biomaterials, 2009, 30(14):2716-2723.

[17] 劉一涵, 趙喜聰, 張勇杰,等.不同誘導(dǎo)環(huán)境對(duì)牙周膜干細(xì)胞膜片生物學(xué)特性的影響[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 28(3):279-284.

[18] 寧慧影, 劉宏偉.鼠根端乳頭條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下的牙周膜細(xì)胞膜片與牙本質(zhì)管和煅燒骨間的牙周膜再生[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 29(4):429-433.

[19] 唐雪鵬, 李適廷, 王 崇,等.兩種誘導(dǎo)液對(duì)牙周膜干細(xì)胞膜片生物學(xué)活性影響[J].臨床軍醫(yī)雜志, 2017, 45(4):373-377.

[20] Yang L, Cheng F, Liu T,etal.Comparison of mesenchymal stem cells released from poly(N-isopropylacrylamide) copolymer film and by trypsinization[J].J Biomed Mater,2012,7(3):035.

[21] Kumashiro Y, Fukumori K, Takahashi H,etal.Modulation of cell adhesion and detachment on thermo-responsive polymeric surfaces through the observation of surface dynamics.[J].J Colloids Surf B Biointerfaces, 2013, 106(3):198-207.

[22] Wang J, Chen L, Zhao Y,etal.Cell adhesion and accelerated detachment on the surface of temperature-sensitive chitosan and poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels[J].J Mater Sci Mater Med, 2009, 20(2):583-590.

[23] Tang Z, Okano T.Recent development of temperature-responsive surfaces and their application for cell sheet engineering[J].J Regen Biomater,2014,1(1):91-102.

[24] Guillaume-Gentil O, Akiy ama Y, Schuler M,etal.Polyelectrolyte Coatings with a Potential for Electronic Control and Cell Sheet Engineering[J].J Adv.Mater, 2008, 20(3):560-565.

[25] Ito A, Hayashida M, Honda H,etal.Construction and harvest of multilayered keratinocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force[J].J Tissue Eng, 2004, 10(5-6):873.

[26] Zahn R, Thomasson E,Guillaume-Gentil O,etal.Ion-inducedcellsheet detachment from standard cell culture surfaces coated with polyelectrolytes[J].J Biomaterials,2012,33(12):3421-3427.

[27] Qiu F, Chen Y, Cheng J,etal.A simple method for cell sheet fabrication using mica surfaces grafted with peptide detergent AK[J].J Macromol Biosci, 2010 ,10(8):881-886.