雞巴氏桿菌的分離鑒定及體外抑制實驗

邊彥超，劉小蘭，康紹珠，李雅婷，梁詩毅，曹剛，陳飛虎，陳林文，朱芝秀

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西南昌330045）

雞巴氏桿菌病，又稱雞出血性敗血癥，是由多殺性巴氏桿菌引起的雞、火雞等多種禽類的傳染病?；疾游锖蛶Ь鷦游锸潜静〉闹匾獋魅驹?，病死率較高，沒有明顯的季節(jié)性，但在氣候劇變之時多發(fā)。本病多呈散發(fā)或地方性流行，同種動物之間相互傳染，不同種種動物間偶見相互傳染［1］。

圖1 皮膚、黏膜、漿膜出血

圖2 胸腔積液

圖3 肝針尖狀壞死

圖4 心肌、心冠脂肪、心內(nèi)外膜點狀出血

圖5 腸道彌漫性出血

2015年5月中旬，江西南昌某養(yǎng)雞場發(fā)生疑似雞巴氏桿菌病病例，剖檢發(fā)病雞可見全身皮膚、黏膜、漿膜點狀或片狀出血（圖1）；胸腔積液，有纖維素性滲出物 （圖2）;肝表面有密集的針尖大小的灰白色的壞死點（圖3）；心肌、心冠脂肪、心內(nèi)外膜點狀出血（圖4）；腸道彌漫性出血（圖5）。臨床上呈急性敗血性死亡癥，初診為雞巴氏桿菌病。取壞死肝臟無菌操作細菌分離，進行實驗室診斷，確定為由多殺性巴氏桿菌引起的雞出血性敗血癥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：死亡雞，來自江西南昌某養(yǎng)雞場；實驗雞，購自江西農(nóng)大動科院養(yǎng)禽小組。

1.1.2藥品及試劑：5%兔血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基（自行配制）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物責任有限公司）；藥敏試紙、微量發(fā)酵管（杭州天和微生物有限公司）；雞唾液乳酸桿菌由江西農(nóng)大動科院預(yù)防獸醫(yī)教研室保存。

1.1.3實驗儀器：AIR TECH超凈工作臺 （蘇凈集團安泰公司）；COCI光學(xué)顯微鏡 （重慶光學(xué)儀器廠）；Motic數(shù)碼顯微鏡 （麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；HH.BII.420BS電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進科學(xué)儀器廠）；LDZX-40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1細菌分離培養(yǎng)：采取病死雞的肝、脾、心等組織，觸片、瑞氏染色；同時無菌操作劃線接種于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、溶血狀況等，挑選單個典型菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其菌體形態(tài)特征。挑取經(jīng)過革蘭氏染色后的單個菌落，劃線接種于5%兔血瓊脂平板，放入生化培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h，進行純培養(yǎng)。純培養(yǎng)后的分離株分別命名為 JX01、JX02、JX03、JX04、JX05。

1.2.2分離菌生理生化特性：將分離菌分別接種至微量生化反應(yīng)管中，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h，觀察其生長變化情況，方法按微量生化反應(yīng)管說明書進行，發(fā)酵管分別加入1～2滴無菌血清。

1.2.3體外抑菌實驗

1.2.3.1分離菌藥敏實驗：按照瓊脂擴散法［2］做藥敏試驗，將分離菌血清肉湯培養(yǎng)液分別涂抹5%兔血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，測量其抑菌圈的大小。

1.2.3.2雞唾液乳酸桿菌對分離菌體外抑制實驗。將分離菌分別接種于血清肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，均勻涂抹于血清瓊脂培養(yǎng)，其上放置牛津杯，將雞唾液乳酸桿菌加入牛津杯至滿，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察并測量抑菌圈大小。

1.2.4致病性試驗：將分離菌無菌操作，接種于血清肉湯培養(yǎng)基，放入生化培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24h。分別取0.5mL血清肉湯培養(yǎng)物，肌肉注射3只健康試驗雞;同時，分別取0.5mL血清肉湯培養(yǎng)物，口腔喂服3只健康試驗雞，24h觀察其發(fā)病情況。并將發(fā)病死亡的試驗雞進行細菌分離培養(yǎng)，染色鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 分離菌培養(yǎng)特性

病死雞的肝、脾、心等組織瑞氏染色鏡檢，均可見菌體呈兩端鈍圓、兩極濃染的橢圓形小桿菌（圖7），疑為巴氏桿菌。兔血瓊脂平板和TSA培養(yǎng)基上均分離到形態(tài)一致的菌落。兔血瓊脂平板上菌落生長良好、不溶血，呈半透明、濕潤、似露滴狀，表面閃光（圖8）；TSA培養(yǎng)基上菌落直徑在1 mm左右、灰白色、濕潤、光滑；麥康凱培養(yǎng)基上不生長。單個菌落染色鏡檢，均為革蘭氏陰性短桿菌，菌體兩端鈍圓，大小為 0.25～0.4μm×0.5～2.5μm，單個或成雙排列（圖 9）。

圖6 乳酸菌體外抑制

圖7 瑞氏染色（10×100）

圖8 閃光小菌落

圖9 革蘭氏染色（10×100）

2.2 分離菌生理生化鑒定

實驗結(jié)果：靛基質(zhì)、枸櫞酸鹽、尿素酶等陰性；分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；對乳糖不能分解；能還原硝酸鹽。見圖10、表1。

表1 分離菌生理生化特性

2.3 分離菌藥敏實驗

結(jié)果如表2，分離菌對大部分抗生素耐藥；對青霉素G、羧芐青霉素、阿莫西林等青霉素類抗生素完全耐藥；對卡那霉素、紅霉素、氧氟沙星中等敏感。

2.4 雞唾液乳酸桿菌對分離菌體外抑制實驗

表2 藥敏試驗結(jié)果 mm

5 株分離菌的抑菌圈分別為：24、26、25、31、 33mm，如圖 6。

圖10 分離菌生化試驗

圖11 雞胸腔積液

圖12 心包積液,肝臟壞死點

圖13 食道漿膜出血

圖14 氣管環(huán)死出血

2.5 致病性試驗

3只肌肉接種0.5mL致病菌液健康雞12d內(nèi)死亡，3只口腔喂服雞24d內(nèi)死亡。解剖口腔喂服死亡雞，可見胸腔有橙黃色透明的積液(圖11);心包內(nèi)有大量橙黃色透明液體，肝臟有大量壞死點(圖12)；食道漿膜出血(圖13);氣管環(huán)出血(圖14)。從試驗雞肝臟中分離到與原分離菌染色形態(tài)、培養(yǎng)特性完全一致的的細菌。

3 討論

3.1根據(jù)臨床病理特癥，分離菌形態(tài)特性，菌落培養(yǎng)特性及生化試驗、藥敏試驗、致病性試驗等試驗結(jié)果，比對伯杰氏細菌分離鑒定手冊［3］，確診該分離菌為多殺性巴氏桿菌。

3.2本分離菌與多殺性巴氏桿菌標準菌株生理生化特性大部分一致［4～6］，只有個別糖發(fā)酵試驗［19］以及硫化氫試驗［20］不同，可能因為菌株變異造成。

3.3分離菌對青霉素G、羧芐青霉素、阿莫西林等青霉素類抗生素完全耐藥，與杜冬華發(fā)表的論文［18］相同，與劉紅玉發(fā)表的論文［15］不同；對卡那霉素、紅霉素、氧氟沙星中等敏感，與黃忠森［16］發(fā)表的論文相同，與馬增軍［17］發(fā)表的論文不同。這可能是由于地域、菌株差異等造成。

3.4長期以來，在臨床上大量使用抗生素，造成分離菌耐藥性越來越強［7～10］，尋找減少或取代抗生素的有益菌迫在眉睫。本實驗所做的乳酸菌體外抑制實驗取得了的較好效果，可為后期運用于臨床提供理論根據(jù)。

3.5本分離菌致病性試驗，實驗動物呈急性出血性敗血癥，病變剖檢發(fā)病雞可見全身皮膚、黏膜、漿膜點狀或片狀出血；胸腔積液，有纖維素性滲出物;肝表面有密集的針尖大小的灰白色的壞死點；心肌、心冠脂肪、心內(nèi)外膜點狀出血；腸道彌漫性出血。急性敗血性死亡癥，與宋曉娜發(fā)表的論文［21］一致。分離菌致病性強，注射12h就可引起雞死亡，為強毒株。

3.6由多殺性巴氏桿菌引起的雞巴氏桿菌病，對多種動物如雞、鴨、鵝、火雞等都具易感性［11～14］。 因此，不宜混養(yǎng)。平時，應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，做好免疫接種，定期肌肉注射禽霍亂蜂膠滅活疫苗1mL/只［1］。發(fā)生疫病時，應(yīng)立即隔離患病禽，嚴格消毒其污染的場所，進行緊急治療，有條件的養(yǎng)殖場應(yīng)做藥敏試驗選擇有效藥物全群給藥。堅持全進全出的飼養(yǎng)制度。

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