無血清培養(yǎng)基的研究進展

張松 ，喬自林 ，王家敏

（1.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院）

血清組分的復(fù)雜性和不確定性及批次間的差異增加了疫苗等細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)及質(zhì)量控制的難度，同時血清易引起細(xì)菌、真菌、病毒及支原體的污染，增加了疫苗生產(chǎn)的安全性隱患。并且血清本身價格也比較昂貴，這些均使得血清在生產(chǎn)和研究中的應(yīng)用存在諸多不利。在培養(yǎng)基中添加血清對人們所造成的這些困擾，已經(jīng)使得不論是科研人員還是工業(yè)生產(chǎn)企業(yè)對于無血清培養(yǎng)產(chǎn)生了強烈需求。有大量實踐證明無血清培養(yǎng)基不僅能在很大程度上避免或改善含血清培養(yǎng)基所帶來的上述缺陷，而且也能取得良好的培養(yǎng)效果。因此，無血清培養(yǎng)基得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

1 血清培養(yǎng)基存在的問題

人類歷史上第一次培養(yǎng)動物細(xì)胞時所用的添加物是動物血清（如新生牛血清、優(yōu)級胎牛血清等，添加量一般在5%～15%之間)等天然的動物體液性補充物。這些天然的體液性補充物可以在較長的一段時間里維持細(xì)胞生長。它們主要是可以向培養(yǎng)細(xì)胞提供激素、生長因子、貼壁因子、結(jié)合蛋白和其它營養(yǎng)物質(zhì)等。然而，盡管血清對細(xì)胞具有良好的生長促進作用，但使用血清作為培養(yǎng)基的添加劑依然存在很多問題。

1.1 高成本和可用性問題

血清作為培養(yǎng)基中的重要營養(yǎng)物質(zhì)來源，血清可占總體成本的85%～90%。比如在新西蘭等發(fā)達(dá)國家，其血清成本花費高達(dá)500~1000美元/L不等。另外，含血清培養(yǎng)基的可用性也各有不同，特別是對于那些關(guān)注動物福利的國家，當(dāng)?shù)鼐用駥⒑游铽@得血清的行為極其抵制。

1.2 倫理問題

從牛胎兒中獲得血清引起了國際社會對動物福利的關(guān)注，如對實驗動物造成傷害，存在著道德和倫理上的問題［1］。

1.3 血清批間差異問題

季節(jié)的交替、地域的跨越、動物個體或群體的差異，這些不同均會造成血清的批次間差異。另外，血清的組成存在可變性和不一致性，這也會導(dǎo)致培養(yǎng)基對細(xì)胞具有不一致的促生長能力。此外，每批培養(yǎng)基的質(zhì)量會隨著供體奶牛的飲食和身體狀況的變化而變化。這種變化也會導(dǎo)致培養(yǎng)基的促生長特性發(fā)生顯著差異，最終導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)過程的生長能力和速度的巨大差別。

1.4 成分問題

動物血清成分復(fù)雜，其包含有促進細(xì)胞生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分。還含有少量的細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制成分，這些成分會影響細(xì)胞的生長與表達(dá)。此外，在生物反應(yīng)器中生長的細(xì)胞通常是將目標(biāo)產(chǎn)物（一般是蛋白質(zhì)）分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中。如果培養(yǎng)基所用的是10%的血清，血清中的蛋白質(zhì)濃度通常很高，接近10 g/L。 相比之下，由細(xì)胞分泌的靶向蛋白質(zhì)的濃度大多數(shù)情況下僅僅有0.1～1g/L，在這種情況下，想要將細(xì)胞的目標(biāo)產(chǎn)物和血清中的蛋白分離將會面臨很大的挑戰(zhàn)。更甚，如果我們的細(xì)胞目標(biāo)產(chǎn)物是單克隆抗體，則其會與血清中存在的其他抗體混合，這將導(dǎo)致兩者的分離工作更加困難。

1.5 高污染風(fēng)險問題

污染通常來自存在于動物血清中的病毒和支原體以及與牛海綿狀腦病相關(guān)的朊病毒。有研究表明35%～50%的商業(yè)含血清培養(yǎng)基是病毒陽性［2］。另有研究表明，來源于肉制品的新型Creutzfeldt-Jakob?。ㄈ祟惏姹镜呐：＞d狀腦病）的發(fā)生很大原因要歸咎于培養(yǎng)基中添加了牛血清。雖然被污染的生物制劑可能不會最終走向市場，但也沒有人想要在制造的生物制藥中冒這種污染的風(fēng)險去生產(chǎn)。

2 無血清培養(yǎng)基的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)50年代，Eagle等科學(xué)家通過采用科學(xué)的研究手段確定了哺乳動物細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)組成成分，并通過試驗確定了可以促進細(xì)胞生長時這些營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基中的最低成分，Eagle等的這些發(fā)現(xiàn)豐富了人們對無血清培養(yǎng)基的認(rèn)識，當(dāng)時普遍得出結(jié)論認(rèn)為最小必需培養(yǎng)基至少得包括13種氨基酸、8種維生素和6種離子物質(zhì)及其它微量組分［3］。向培養(yǎng)基中添加動物來源的血清可以為動物細(xì)胞提供細(xì)胞生長的營養(yǎng)需求，但實驗證明向培養(yǎng)物中增加Eagle最小必需培養(yǎng)基的組分濃度可獲得同樣的細(xì)胞密度。向基礎(chǔ)配方 （如Dulbecco's Egles培養(yǎng)基（DMEM））中調(diào)整營養(yǎng)成分的添加量可以選擇出細(xì)胞系的克隆細(xì)胞。Ham早期研究生產(chǎn)出眾所周知的Ham's F-12培養(yǎng)基，隨后，佐藤巧妙將Dulbecco's Egles培養(yǎng)基和Ham's F-12培養(yǎng)基混合得到混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑DMEM/F-12，這種混合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑一段時間被廣泛用于多種細(xì)胞系生長至高密度［4］。這些明確成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑中含有多達(dá)70種補充組分，但它們中的每種成分對于提供大多數(shù)細(xì)胞系的持續(xù)生長都是必要的。目前，已有大量試驗數(shù)據(jù)證實無血清培養(yǎng)基不但可以避免或改善由含血清培養(yǎng)基所帶來的各種缺陷，而且在能得到優(yōu)良的培養(yǎng)效果的同時還可以維持細(xì)胞原有生物學(xué)功能［5］。

使用動物血清作為培養(yǎng)細(xì)胞重要營養(yǎng)物質(zhì)的來源存在諸多問題，這些使得科學(xué)家們對無血清培養(yǎng)基的開發(fā)產(chǎn)生了越來越強烈的欲望。在科學(xué)研究領(lǐng)域，無血清培養(yǎng)基對于保證培養(yǎng)基一致性以及降低血清批次間差異性具有重要的作用。在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中，對細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝也會產(chǎn)生很大影響。使用無血清培養(yǎng)基能很大程度地降低朊病毒對細(xì)胞污染的風(fēng)險，在主流歐美發(fā)達(dá)國家，各個國家監(jiān)管當(dāng)局已經(jīng)要求盡可能使用無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)生物制品。歐洲替代方法研究中心科學(xué)咨詢委員會和歐洲體外毒理學(xué)會等多個機構(gòu)組織均發(fā)表聲明，強烈建議減少或終止細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中血清等動物源性物質(zhì)的添加，盡可能在現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域使用無血清培養(yǎng)基［6］。由此可見，無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究日益受到人們的重視，并開始逐漸成為當(dāng)今動物細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域研究的重點與趨向。

3 無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程

無血清培養(yǎng)基是從合成培養(yǎng)基的發(fā)展基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的，無血清培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基進行對比，不但可以滿足細(xì)胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)長時間培養(yǎng)的要求，而且可以避免使用動物血清所帶來的不利影響。無血清培養(yǎng)基發(fā)展至今，大致經(jīng)過了以下三個階段，第四代培養(yǎng)基的研制開發(fā)并投入市場將成為當(dāng)今的發(fā)展趨勢［7］。

3.1 無血清培養(yǎng)基(Serum-Free Medium，SFM)

無血清培養(yǎng)基，顧名思義，為不添加動物來源血清的培養(yǎng)基?？墒菫榱藵M足細(xì)胞的生長要求，常會向培養(yǎng)基中添加替代血清生物功能的原料，如一些動植物的提取物、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等。這些添加物使得此類培養(yǎng)基中含大量動植物來源蛋白，添加動植物的提取物使得培養(yǎng)基化學(xué)成分也變得不夠明確。因此，會對后續(xù)處理應(yīng)用造成不利影響（如目標(biāo)蛋白的分離純化），同時也會增加成本。在具體的實驗過程中，由于人們可以就實際需求對培養(yǎng)基進行相對簡單的成分改進，使得此類培養(yǎng)基的應(yīng)用至今仍較為廣泛。不含血清，但含有大量的動物或植物來源蛋白，蛋白含量偏高(低于有血清培養(yǎng)基)，不利于目標(biāo)蛋白如BSA和動物激素等蛋白的分離純化，降低了回收率，增加了成本，這些均是此類培養(yǎng)基目前存在的缺點。

3.2 無動物源培養(yǎng)基（Animal Component Free Medium，ACFM）

無動物源培養(yǎng)基是利用化學(xué)重組蛋白、有機化學(xué)物質(zhì)、其他水解物來取代動物源蛋白。此類培養(yǎng)基完全不用動物來源蛋白 (也無動物衍生蛋白），其大大降低了生產(chǎn)成本，加快了報批的速度，其具有諸多優(yōu)點，是目前生物市場上銷售的主要無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品。

3.3 無蛋白培養(yǎng)基(Protein-Free Medium，PFM)

無蛋白培養(yǎng)基完全不含有血清蛋白和動物來源蛋白，但其中仍會添加來源于植物的蛋白水解物或合成的多肽片段以及其他衍生物。但此類培養(yǎng)基蛋白質(zhì)添加量極低，并且蛋白質(zhì)成分特別明確。這些均有利于細(xì)胞蛋白質(zhì)產(chǎn)品的下游生產(chǎn)、分離和純化，總體成本也會大幅下降［8-9］。但此類培養(yǎng)基同樣具有缺點，其通用性較差，需要針對目標(biāo)細(xì)胞株進行特異性的優(yōu)化［10］。

3.4 化學(xué)成分限定培養(yǎng)基(Chemically Defined Medium，CDM)

化學(xué)成分限定培養(yǎng)基特點是完全無血清、無蛋白、成分完全明確，可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性和無差異性。除此之外，化學(xué)成分限定培養(yǎng)基適合多種不同細(xì)胞生長而且可以對其進行高溫消毒。第四代培養(yǎng)基的研究和使用將成為發(fā)展重點和趨勢。

4 無血清培養(yǎng)基的組成及其主要添加因子

無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)和合適比例的激素、生長因子、貼壁因子和結(jié)合蛋白等添加因子而組成。

4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常是將葡萄糖、氨基酸、無機鹽和維生素等按一定比例組合而成的合成培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基對于維持組織或細(xì)胞生長代謝必不可少。其成分是完全已知的，因此在對不同的細(xì)胞株進行培養(yǎng)時可以對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的某些組分添加量進行相應(yīng)的調(diào)整，從而更好的符合細(xì)胞株的營養(yǎng)要求并提高目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。

4.2 主要添加因子

截止目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多數(shù)生物材料因子單獨添加或一起使用可替代血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的功效。很多研究表明，不同來源的細(xì)胞其營養(yǎng)需求有差別［11］。即使同一個細(xì)胞系中為不同種細(xì)胞設(shè)計的培養(yǎng)基其補加成分也不盡相同，但對于大多數(shù)細(xì)胞系(株)而言，主要添加因子有以下幾種。

4.2.1激素和生長因子。多半細(xì)胞在使用無血清培養(yǎng)時需要加入某些激素，比如胰高血糖素、生長激素和胰島素等。其中，胰島素是最為重要的一類激素。大多數(shù)細(xì)胞系都需要加入胰島素，胰島素是一種常見的多肽，其可以和細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合形成復(fù)合體，其可以促進RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸三者的合成，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用，是比較重要的細(xì)胞存活因子。除了胰島素外，很多哺乳動物細(xì)胞還需要一定量的其它多種激素。比如像多肽類激素中的甲狀腺素、胰高血糖素甲狀生長激素等，甾體類激素中的雌二醇、氫化可的松和孕酮等。不同細(xì)胞株對激素的種類和數(shù)量要求有所不同，常用的激素和溶度見表1。

表1 常用的激素和溶度

生長因子，其是維持細(xì)胞體外生長增殖、分裂分化所必需的生物補充因子。按其化學(xué)性質(zhì)進行分類，可將其分為多肽類生長因子和甾類生長因子。無血清培養(yǎng)基中添加的生長因子通常是多肽類生長因子。較常用的有表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和神經(jīng)生長因子。有研究證明表皮生長因子的添加量要依據(jù)各種細(xì)胞的生長特性的不同而做出改變，但其通常添加的溶度范圍一般在1～100ng·mL-1之間；神經(jīng)生長因子的添加量較表皮生長因子較低，添加溶度一般控制在1～10ng·mL-1之間；成纖維素細(xì)胞生長因子的添加溶度一般控制在1～100μg·mL-1之間。

4.2.2結(jié)合蛋白。在無血清培養(yǎng)基中，添加結(jié)合蛋白是非常有必要的。通常添加的結(jié)合蛋白包括兩種蛋白質(zhì)，一種是轉(zhuǎn)鐵蛋白，另外一種是白蛋白。

轉(zhuǎn)鐵蛋白是細(xì)胞無血清培養(yǎng)中最重要的補充因子之一，它可以促進細(xì)胞的生長，同時它也是一些有害微量元素的螯合劑［12］。

白蛋白可以作為微量營養(yǎng)素的載體，其可保護細(xì)胞免受不利pH波動和剪切力對細(xì)胞造成的影響。同時，白蛋白也是無血清培養(yǎng)基中最重要的添加因子之一。其通過與維生素、脂類、激素、金屬離子和生長因子的結(jié)合，起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)在無血清培養(yǎng)中的活性作用。除此之外，其還具有結(jié)合毒素和減輕蛋白酶對細(xì)胞影響的作用［13］。

4.2.3貼壁因子。絕大多數(shù)的真核細(xì)胞在體外生長時是需要固著在適宜的基底上。細(xì)胞固著是一個比較復(fù)雜的過程，包括貼壁因子吸附于器皿或載體的表面、細(xì)胞與貼壁因子的結(jié)合等。無血清培養(yǎng)中常用的貼壁因子有細(xì)胞間質(zhì)成分和血清中的成分，如纖粘連蛋白、膠原、昆布氨酸和多聚賴氨酸。

4.2.4微量元素。微量元素是細(xì)胞體外培養(yǎng)的一類重要添加因子，而硒是其中最常見的微量元素，有研究表明，硒在任何一種細(xì)胞尤其是在人體細(xì)胞的生長過程中起到特別重要的作用。在生物代謝方面，微量元素硒參與谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧化酶的作用過程，可以消除氧化物酶和氧自由基對細(xì)胞的傷害。亞硒酸鈉的最適添加濃度是30～60nmol·L-1［14］。

5 發(fā)展無血清培養(yǎng)基遇到的問題及其開發(fā)設(shè)計

5.1 遇到的問題

發(fā)展無血清培養(yǎng)基要克服的主要困難是不能找到等同作用的生長促進因子。生長促進因子的添加在不同的細(xì)胞系中存在很大差異，包括培養(yǎng)基中生長促進因子的添加種類差異和生長促進因子的添加量差異。培養(yǎng)細(xì)胞需要廣泛的生物活性成分，設(shè)計出一種普遍適用的無血清制劑作為適合所有細(xì)胞系的血清替代物目前還面臨諸多困境。有研究表明，很多細(xì)胞系的不同克隆株對無血清制劑的要求甚至也不一樣。

發(fā)展無血清培養(yǎng)基制劑的目的是替代培養(yǎng)基中血清的功效，無血清培養(yǎng)基制劑需要補充生長因子、維生素、微量元素、激素和基礎(chǔ)培養(yǎng)基未提供的其他微量營養(yǎng)素等必需組分?？茖W(xué)家早期開發(fā)無血清培養(yǎng)基制劑時將動物來源的成分歸納為胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白和膽固醇替代物。然而，這種培養(yǎng)基制劑仍然具有含有相對高的蛋白質(zhì)含量和源自動物來源的成分的缺點。沒有典型無血清培養(yǎng)基的特點：無蛋白質(zhì)成分（PF）和動物衍生成分（ADCF）的兩個重要標(biāo)準(zhǔn)。

在食品工業(yè)中廣泛使用的植物和微生物來源肽水解產(chǎn)物，目前已經(jīng)成為促進哺乳動物細(xì)胞生長的非動物成分的主要來源。科學(xué)家們通常通過統(tǒng)計學(xué)實驗方案的設(shè)計，將各種來源如大豆、小麥面筋和酵母的最佳混合物補充到培養(yǎng)基中。通過這些水解物和混合物中的營養(yǎng)成分和生長因子的組合優(yōu)化以促進細(xì)胞生長［15］。有研究表明這些生物活性成分具有明顯的優(yōu)點，當(dāng)然也存在一些問題，比如盡管可以改進處理方法使水解產(chǎn)物的批次間變化最小化［16］，但對于這些水解產(chǎn)物含量的批次間變化還是有差異。

5.2 開發(fā)設(shè)計

據(jù)報道，有超過450種不同的無血清制劑可用于各種細(xì)胞系的培養(yǎng)［17］。 但不足的是，這些培養(yǎng)基是專有的，只能用于培養(yǎng)單一種細(xì)胞。

目前，可以使用多種策略設(shè)計無血清制劑。使用標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行不同組合，并將血清降低至細(xì)胞生長的最低水平。在培養(yǎng)過程中對特定營養(yǎng)的攝取率和消耗量進行測定，進行代謝分析識別補充關(guān)鍵組分的要求。用Plackett-Burman矩陣實驗統(tǒng)計設(shè)計可以確定生長時最大生產(chǎn)力關(guān)鍵組分的最佳混合物溶度［18］。其是通過利用cDNA微陣列分析提取的RNA，對細(xì)胞生長期間表達(dá)的特異性受體的微陣列分析鑒定，然后用相應(yīng)的配體補充培養(yǎng)基以刺激相關(guān)的信號通路［19］。使用這些技術(shù)，可以設(shè)計出所需標(biāo)準(zhǔn)的無血清培養(yǎng)基，可以滿足細(xì)胞高生長速率、高細(xì)胞產(chǎn)量、高生產(chǎn)力的要求。

6 展望

無血清培養(yǎng)基經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)經(jīng)歷了三次大變革。雖然尚存在著諸多不足，如只能用于一種或少數(shù)幾種細(xì)胞高密度生長或高水平表達(dá)目的產(chǎn)物，缺少通用性；培養(yǎng)基相對較難保存；無血清培養(yǎng)基制劑的使用成本還是比較昂貴。但伴隨著人們對細(xì)胞代謝和外源蛋白表達(dá)機制以及細(xì)胞凋亡的機制的認(rèn)識的愈加深入、細(xì)胞培養(yǎng)基的不斷優(yōu)化、實驗過程中更加科學(xué)便捷的方法的采用。無血清培養(yǎng)基的發(fā)展將會越來越好。針對無血清培養(yǎng)基通用性的問題，有待于研究具有廣泛適應(yīng)性的培養(yǎng)基。另外，無血清培養(yǎng)基目前還存在成本較高的問題，因此，降低無血清培養(yǎng)基成本的方法值得探索。培養(yǎng)基的保存方法問題也急需科學(xué)家們?nèi)ソ鉀Q。其次，將無血清培養(yǎng)基與反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合將會成為新的研究熱點，如何將無血清培養(yǎng)基和反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)目的產(chǎn)物將有待于我們的持續(xù)研究和探索。

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