新型基質(zhì)對生物膜微生物數(shù)量和酶活性的影響

馬恒軼，葛利云，吳靈萍，鄧歡歡

(溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

隨著城市的發(fā)展，城區(qū)河流護(hù)堤岸坡因水土保持等功能需求普遍采用硬質(zhì)化護(hù)砌，切斷了水體與陸地間的物質(zhì)、能量及信息交流，綠色植物和微生物失去了生存空間，造成生物多樣性降低、生態(tài)系統(tǒng)瓦解破碎[1]。由于城市河道獨特的歷史形成原因和現(xiàn)狀，對于城市河流的修復(fù)，若完全重建代價太大，而如果進(jìn)行合理的改造，城市河道也能夠提供適當(dāng)?shù)纳飾⒌兀尚械霓k法之一是在保留原有水工結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上增加一些人工措施來調(diào)整棲息地，如美國應(yīng)用較多的拋石及碎石護(hù)岸、日本的石籠和魚巢磚，以及歐洲開發(fā)的生態(tài)浮床[2]。本研究引入一種新型人工基質(zhì)，系聚氯乙烯或聚丙烯經(jīng)亂絲熱熔相互搭接，再經(jīng)模具擠壓成型的三維網(wǎng)狀材料，以溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)校河為研究對象，通過測定、比較新型人工基質(zhì)和石岸基質(zhì)夏(6月)、秋(9月)、冬(12月)3季生物膜上的磷酸酶、脲酶、脫氫酶活性和微生物總數(shù)量，來驗證新型人工基質(zhì)的效用?，F(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 處理設(shè)計

設(shè)定3個試驗點：分別使用種植植物的新型人工基質(zhì)(A)、新型人工基質(zhì)(B)、石頭基質(zhì)(C)。其中，在A、B兩點上分別懸掛一定數(shù)量提前切好的小塊方形基質(zhì)，C點懸掛若干量的鵝卵石。

1.2 樣品采集

分別在A、B、C點撈取布設(shè)的基質(zhì)塊和石塊，用蒸餾水洗去表面附著的非生物雜質(zhì)，放入燒杯中，加入約400 mL蒸餾水，采用物理法使表面生物膜剝落。超聲處理15 min(超聲頻率50 Hz)，將溶液轉(zhuǎn)移到1 000 mL錐形瓶中，加入適量微型玻璃珠，充分振蕩15 min，得到均勻的生物膜混合液，以此作為生物膜樣品進(jìn)行測定[3]，每個樣點做3個平行。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 微生物總數(shù)

取生物膜混合液樣品1 mL，經(jīng)100倍梯度稀釋，然后用無顆粒甲醛進(jìn)行固定(終濃度2%)，固定后的樣品用無菌超純水進(jìn)行5～10倍(視不同樣品而定)稀釋。取10 mL稀釋液超聲波振蕩10 min，加入100 μL濃度為100 μg·mL-1的DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，Sigma，USA)靜置染色10 min，然后用手持式手動泵(MityVac，USA)以<1.33 kPa的真空壓將染色后的樣品過濾至黑背景聚碳酸濾膜(孔徑0.22 μm，直徑25 mm，PoretiesTM，USA)上，滴1滴無熒光鏡油，至熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。每個樣品觀察20個視野[4]，計數(shù)公式如下：

式中，n表示微生物豐富度(個·mL-1)，N表示樣品稀釋倍數(shù)，A表示所有視野中細(xì)菌的平均數(shù)(個)，S1表示濾膜的有效過濾面積(μm2)，S2表示視野面積(μm2)，V表示過濾水樣體積(mL)。將得到的微生物豐富度(n)乘以400，再除以基質(zhì)或者石塊的總表面積，得到單位面積基質(zhì)或者石塊的微生物個數(shù)。

1.3.2 磷酸酶活性

基質(zhì)磷酸酶活性的測定采用磷酸苯二鈉法[5]：取10 mL生物膜懸液離心后棄去上清液，用1 mL蒸餾水懸浮于150 mL錐形瓶中。加入2.5 mL甲苯，振蕩15 min后，加入20 mL 0.5%的磷酸苯二鈉(pH值7.0)溶液，37 ℃水浴培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入100 mL 0.3%鋁鉀礬溶液，過濾。取5 mL濾液，加入5 mL硼酸緩沖液和4滴氯代溴苯醌亞胺試劑，搖勻顯色。靜置30 min后，于波長660 nm處比色測定，換算出酚量。以1 g生物膜每24 h釋放出酚的量表示酶活性。

1.3.3 脲酶活性

基質(zhì)脲酶活性的測定采用奈氏比色法[5]：取10 mL生物膜溶液離心之后棄去上清液，用1 mL蒸餾水濃縮，置于50 mL離心管中。加入10 mL pH 值6.7磷酸緩沖液及0.5 mL甲苯，混合處理15 min后，加入10 mL 10%尿素溶液，37 ℃水浴培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出加入20 mL 1 mol·L-1KCl溶液，充分搖勻10 min。將懸液用致密濾紙過濾，吸取經(jīng)過稀釋的濾液1 mL，加入1 mL 25%酒石酸鉀鈉、0.8 mL納氏試劑進(jìn)行顯色。靜置10 min后，以空白為對照，在波長460 nm處比色測定。以1 g生物膜每48 h釋放出氨的量表示酶活性。

1.3.4 脫氫酶活性

基質(zhì)脫氫酶活性測定采用TTC-脫氫酶測定法[6]：取10 mL生物膜懸液，4 000 r·min-1離心5 min，濃縮成2 mL制備液，棄去上清液，用1 mL蒸餾水濃縮于15 mL離心管中，依次加入Tris-HCl緩沖液、0.1 mol·L-1葡萄糖溶液、0.5%TTC各2 mL，37 ℃恒溫水浴培養(yǎng)6 h。取出，加2滴濃硫酸終止反應(yīng)，準(zhǔn)確加入5 mL甲苯，振蕩搖勻，4 000 r·min-1離心5 min，取有機(jī)溶劑層比色。在上述條件下，以l h產(chǎn)生1 μg三苯基甲臜(TF)的量作為1個酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在Excel 2007上整理數(shù)據(jù)，利用SPSS 22.0進(jìn)行雙因素方差分析，利用Graphpad Prism 5.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物數(shù)量

在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，浮游細(xì)菌的豐富度、生物量及浮游細(xì)菌種群的基因多樣性均表現(xiàn)出隨時間變化的特征[7-8]。在對瑞士和法國境內(nèi)的3個高山湖泊細(xì)菌豐度的研究中發(fā)現(xiàn)，異養(yǎng)細(xì)菌爆發(fā)期均出現(xiàn)在秋季[9]。本試驗結(jié)果同樣顯示，各試驗點的微生物數(shù)量均以秋季最高(表1)。雙因素方差分析結(jié)果顯示，不同基質(zhì)及不同季節(jié)對試驗結(jié)果有極顯著(P<0.01)影響。不分季節(jié)，各試驗點的微生物數(shù)量均表現(xiàn)為種植植物的新型人工基質(zhì)(A)>新型人工基質(zhì)(B)>石頭基質(zhì)(C)。說明新型人工基質(zhì)相較石頭基質(zhì)可以更有效地富集水體中的微生物，為微生物提供更加適合的生存環(huán)境。陳永華等[10]證明，植物根系生長環(huán)境越好, 根系附近微生物的生存環(huán)境也越適宜, 微生物的數(shù)量越多。這與本試驗中種植植物的新型人工基質(zhì)的微生物數(shù)量最多的結(jié)果一致。

表1 各試驗點不同季節(jié)的微生物數(shù)量 107 cm-2

2.2 基質(zhì)酶活

2.2.1 磷酸酶活性

磷酸酶是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由羥基，是一種普遍存在于多種生物體中的酶[11]。雙因素方差分析結(jié)果顯示，不同基質(zhì)及不同季節(jié)對生物膜磷酸酶活性分別有顯著(P<0.05)與極顯著(P<0.01)影響。整體來看(表2)，磷酸酶活性以秋季最高，冬季最低。在同一季節(jié)，不同試驗點生物膜上的磷酸酶活性均表現(xiàn)為種植植物的新型人工基質(zhì)(A)>新型人工基質(zhì)(B)>石頭基質(zhì)(C)，與微生物數(shù)量的變化規(guī)律一致。

表2 各試驗點不同季節(jié)的磷酸酶活性 mg·g-1·d-1

2.2.2 脲酶活性

脲酶是一種酰胺酶，以尿素為底物，酶促水解有機(jī)物分子中的肽鍵，使之轉(zhuǎn)化為NH3、CO2和H2O，廣泛分布于細(xì)菌、真菌和高等植物中[12]，其活性與基質(zhì)中的微生物量、有機(jī)質(zhì)含量、氮含量呈正相關(guān)[1]。雙因素方差分析結(jié)果顯示，不同基質(zhì)及不同季節(jié)對生物膜磷酸酶活性有顯著(P<0.05)影響。與不同試驗點不同季節(jié)磷酸酶的活性變化相似，脲酶活性同樣以秋季最高(表3)，在同一季節(jié)，不同試驗點生物膜上的脲酶活性均表現(xiàn)為種植植物的新型人工基質(zhì)(A)>新型人工基質(zhì)(B)>石頭基質(zhì)(C)，與微生物數(shù)量的變化規(guī)律一致。但與磷酸酶不同的是，冬季脲酶活性要高于夏季。這主要與脲酶的反應(yīng)方式有關(guān)：冬季植物莖葉部分枯萎，進(jìn)入微生物系統(tǒng)，為系統(tǒng)增加了尿素來源，從而導(dǎo)致相關(guān)微生物大量繁殖，脲酶活性因而增加[11]。

表3 各試驗點不同季節(jié)的脲酶活性 mg·g-1·d-1

2.2.3 脫氫酶活性

脫氫酶是氧化過程中作用在代謝物上的第一個酶，其活性在很大程度上反映了活性微生物的數(shù)量以及生物體的活性狀態(tài)，能直接表示生物細(xì)胞對其基質(zhì)的降解能力[13]。雙因素方差分析結(jié)果顯示，不同基質(zhì)及不同季節(jié)對生物膜脫氫酶活性分別有顯著(P<0.05)與極顯著(P<0.01)影響。整體來看(表4)，不同試驗點生物膜上的脫氫酶活性均表現(xiàn)為種植植物的新型人工基質(zhì)(A)>新型人工基質(zhì)(B)>石頭基質(zhì)(C)，與微生物數(shù)量的變化規(guī)律一致。但與磷酸酶和脲酶不同的是，脫氫酶活性在夏季最高、秋季最低。這是因為：在6月，生命活動相對旺盛，脫氫酶需要大量地轉(zhuǎn)化有機(jī)質(zhì)為系統(tǒng)提供生命元素；在12月，由于系統(tǒng)中植物枯落，腐殖質(zhì)大量增加，脫氫酶需提高活性以加快轉(zhuǎn)化有機(jī)質(zhì)。這與周巧紅等[14]的研究結(jié)果一致。

表4 各試驗點不同季節(jié)的脫氫酶活性 μg·g-1·h-1

3 小結(jié)

本研究對同一河段中種植植物的新型人工基質(zhì)、新型人工基質(zhì)和石頭基質(zhì)上生物膜磷酸酶、脲酶和脫氫酶活性及微生物總數(shù)進(jìn)行測定。結(jié)果表明，微生物數(shù)量在秋季最高，磷酸酶和脲酶活性在秋季最高，而脫氫酶活性在夏季最高、秋季最低。在同一季節(jié)，3種酶活性都表現(xiàn)出種植植物的新型人工基質(zhì)>新型人工基質(zhì)>石頭基質(zhì)的趨勢，微生物數(shù)量的變化趨勢也與此一致。說明新型人工基質(zhì)可以為微生物提供更多的生存場所和更好的生存環(huán)境。在新型人工基質(zhì)上種植植物后，植物根系的生長可為微生物生存提供營養(yǎng)，進(jìn)一步提高微生物數(shù)量。受此影響，酶活性也相應(yīng)增強(qiáng)，從而更好地起到凈化水質(zhì)的作用。

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