梓醇對AD模型細(xì)胞中海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

宋沖，曹斌

（長沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219）

引言

谷氨酸屬于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量最高的一類興奮性氨基酸，在人體生理活動(dòng)中負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等功能，當(dāng)腦內(nèi)谷氨酸含量過高時(shí)即可造成神經(jīng)元損傷[1]。當(dāng)前阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的治療中即有學(xué)者提出通過干預(yù)谷氨酸損傷神經(jīng)元達(dá)到治療AD 患者的目的，本文為深入研究梓醇對海馬神經(jīng)元凋亡的影響，利用大鼠制作AD 模型完成觀察。

1 材料及方法

1.1 一般材料 梓醇自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司處購得，CAS 號(hào)：2415-24-9，DMEM/F12 培養(yǎng)基自GIB 公司處購得，噻唑藍(lán)（MTT）、多聚賴氨酸從sigma公司購買，LDH 檢測試劑由南京建成生物工程研究所提供，流式細(xì)胞儀器為德國CELLASIC 生產(chǎn)，型號(hào)ONIX perfusion syste。SD 大鼠來自凱學(xué)生物科技（上海）有限公司提供。

1.2 方法

海馬神經(jīng)的培養(yǎng)與測定：無菌條件完成海馬分離，培養(yǎng)基清潔后將海馬組織剪成1 mm3小塊，利用膠原酶消化40 min，膠原酶pH 值控制在6.5-7.0，濃度0.5%，溫度37℃，每10 min 完成搖晃吹打1 次，后續(xù)利用200 目鋼網(wǎng)完成過濾，離心10 min（轉(zhuǎn)速1000 r/min），濾取上清液后加入一定培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，控制細(xì)胞密度保持在1×109/L，隨后以1 ml/孔接種在24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種2 d 后更換低血清培養(yǎng)液，24 h 后在再換為DEEM/F12 培養(yǎng)液，后續(xù)每2 d 更換培養(yǎng)液1 次，更換量為原液量的一半。

分組：取出已培養(yǎng)7-9 d 的海馬神經(jīng)元，利用隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、AD模型組、干預(yù)組，對照組不進(jìn)行干預(yù)，AD 模型組給予0.1 mmol/l 谷氨酸，干預(yù)組再給予谷氨酸之前給予濃度為0.2、1.0、5.0 mg/l 的梓醇，完成干預(yù)0.5 h 再給予谷氨酸，培養(yǎng)1 d 后完成檢測觀察，對照組、AD 模型組各10 個(gè)復(fù)孔，干預(yù)組高、中、低濃度組各設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。

神經(jīng)元存活情況觀察：加入20 ul 濃度為5 g/L 的MTT，控制溫度在37℃條件下，置入孵育箱（CO2濃度控制在5%），完成4 h 孵育后取出培養(yǎng)液，加入150 ul二甲亞砜，避光條件下完成震蕩，使用酶標(biāo)儀完成570 nm 處吸光度值的測定。

LDH 測定：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用LDH 檢測試劑盒完成LDH40 nm 處吸光度值檢測。細(xì)胞凋亡：利用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，控制細(xì)胞密度至1×109/L，取1 ml 懸液，完成離心后撇去上層清液，再加1 ml 冷PBS，離心后再撇去上清液，使細(xì)胞懸浮于緩沖液內(nèi)，加入AnnexinVFITC（10 ul）及PI（5ul），等待15 min，加入緩沖液后使用流式細(xì)胞儀完成細(xì)胞凋亡情況檢測。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察3 組細(xì)胞凋亡情況、DTH、MTT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 23.0 軟件處理數(shù)據(jù)，（）表示計(jì)量資料，t 檢驗(yàn)，%表示計(jì)數(shù)資料，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

從下表1 可知，AD 模型組細(xì)胞凋亡率、LDH 顯著高于對照組，MTT 顯著更低（P＜0.05），干預(yù)組內(nèi)細(xì)胞凋亡率從高濃度、中等濃度、低濃度組逐次上升，MTT則從低濃度至高濃度逐次升高，LDH 從高濃度至低濃度逐次降低，高濃度組細(xì)胞凋亡率、MTT、LDH 與對照組對比無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

AD 是一種以慢性進(jìn)行性的記憶力減退、認(rèn)知功能障礙及精神行為異常為主要臨床特征的神經(jīng)變性疾病，是引起癡呆的最常見原因。AD 的發(fā)病率隨年齡增長有上升趨勢，隨著全球步入老齡化社會(huì)，AD 發(fā)病人數(shù)急劇上升。AD 發(fā)病后患者隨病情進(jìn)展認(rèn)知能力、記憶能力、運(yùn)動(dòng)能力逐漸下降，最終喪失生活自理能力，為患者及社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[2]。

在臨床治療的嘗試中，有學(xué)者利用梓醇治療本病且取得良好效果，猜測梓醇可在AD 患者治療中對其神經(jīng)細(xì)胞起到一定保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚未證實(shí)[3]。后續(xù)許多學(xué)者圍繞β-淀粉樣蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)梓醇可減輕β-淀粉蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，初步證實(shí)梓醇在本病中的治療價(jià)值，但有關(guān)谷氨酸過量所引起神經(jīng)損傷方面研究較少，本文為彌補(bǔ)研究空白，更全面探悉梓醇對海馬神經(jīng)元凋亡的影響，利用將3 組比較的方式完成本次研究[4]。

表1 三組LDH、MTT、細(xì)胞凋亡率對比（）

表1 三組LDH、MTT、細(xì)胞凋亡率對比（）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與對照比較，#P＞0.05。

本次觀察中，AD 模型組在給予谷氨酸后其細(xì)胞凋亡率較對照組明顯上升，MTT 顯著下降，而LDH 顯著升高（P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了谷氨酸過量對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。而在干預(yù)組的觀察中發(fā)現(xiàn)，在加入氨基酸前，通過加入不同濃密度梓醇的梓醇可達(dá)到保護(hù)海馬神經(jīng)元的目的，且以濃度越大效果越佳，當(dāng)濃度至5.0 mg/l 時(shí)，細(xì)胞凋亡率、MTT、LDH 與對照組比較已無顯著差異（P＞0.05）。在張曉雙[5]等人的研究中進(jìn)一步指出梓醇對于血管性癡呆大鼠神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用，可提高大鼠的學(xué)習(xí)能力及記憶能力，本次研究與其研究存在一定相似性。

綜上所述，梓醇在AD 模型中可有效控制由谷氨酸過量引起的海馬神經(jīng)元凋亡。