牙髓干細(xì)胞的研究進(jìn)展

趙越

摘 要：牙髓干細(xì)胞是從牙髓組織中分離出的成纖維狀細(xì)胞，其存在多種特點(diǎn)，如高度增殖、自我更新、多向分化、來(lái)源豐富、副作用小等，在牙髓修復(fù)、牙齒再生中具有良好的作用。本文以多角度分析牙髓干細(xì)胞，進(jìn)一步了解牙髓干細(xì)胞的應(yīng)用現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：牙髓組織；牙髓干細(xì)胞；分化

中圖分類號(hào)：R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.02.001

文章編號(hào)：1006-1959（2018）02-0001-03

Abstract：Dental pulp stem cells are fibroblast cells isolated from dental pulp tissue，which have many characteristics，such as highly proliferative， self-renewal，multi-directional differentiation，rich source，less side effects and so on，in the pulp repair，tooth regeneration has good effect.This paper analyzes dental pulp stem cells from multiple perspectives to further understand the current status of dental pulp stem cells.

Key words：Pulp tissue；Dental pulp stem cells；Differentiation

牙髓組織屬于牙體組織的唯一軟組織，位于牙齒內(nèi)部的牙髓腔內(nèi)。2000年，牙髓干細(xì)胞（Dental Pulp Stem Cells，DPSCs）被發(fā)現(xiàn)，其免疫表型、形成礦化結(jié)節(jié)能力極其類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，呈梭形形態(tài)，具有較強(qiáng)的克隆能力，同時(shí)還具有自行更新、多向分化等潛能，與其他組織成體肝細(xì)胞的生物學(xué)特性十分相似[1-2]。基于上述事實(shí)，本次研究對(duì)牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)、分選、生物學(xué)特點(diǎn)、非人化誘導(dǎo)因素等方面進(jìn)行如下綜述。

1 牙髓干細(xì)胞

干細(xì)胞（stem cells-SC）是一類多潛能細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力，同時(shí)屬于一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬(wàn)用細(xì)胞”[3]。根據(jù)肝細(xì)胞所處的發(fā)育階段可分為兩種，即成體肝細(xì)胞（somatic stem cell）和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞），前者為新的干細(xì)胞、分化形成新的功能細(xì)胞，便于維持組織、器官的生長(zhǎng)、衰退動(dòng)態(tài)平衡，存在于骨髓、脂肪、血液、神經(jīng)、肝臟等；后者可在體外培養(yǎng)，但由于多種因素的存在，使其應(yīng)用受限。在牙齒形成后，一旦牙本質(zhì)細(xì)胞受到輕度刺激，便會(huì)出現(xiàn)牙本質(zhì)再生、修復(fù)，但成牙本質(zhì)細(xì)胞一經(jīng)分化，便不能再分裂，這種修復(fù)能力的發(fā)生是由于牙髓干細(xì)胞所致[4-5]。王曉航， 巴景斌[6]指出牙髓干細(xì)胞可以有效消除感染、保留患牙等作用；張曉莉[7]以新西蘭大白兔制作動(dòng)物模型、兔損傷面神經(jīng)標(biāo)本為例，結(jié)果顯示出牙髓干細(xì)胞、TGF-β3的再生室修復(fù)，有助于損傷面神經(jīng)再生，提示牙髓干細(xì)胞通過(guò)自身定向分化能力可轉(zhuǎn)變成神經(jīng)干細(xì)胞，對(duì)面神經(jīng)的修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用，利于為面神經(jīng)損傷的臨床治療提供可參考依據(jù)。

2 牙髓干細(xì)胞定位、分離以及鑒定情況的分析

據(jù)報(bào)道，DPSCs可能存在于它們起源組織的微脈管中，并且脈管抗原、平滑肌抗原、毛細(xì)血管抗原標(biāo)志和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相同[8]。并且Gronthos等[9]以免疫組化技術(shù)對(duì)牙髓干細(xì)胞表面分子標(biāo)記進(jìn)行研究，并與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞比較，結(jié)果顯示，均表達(dá)與平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等有關(guān)的分子標(biāo)記，其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)骨涎蛋白、骨基質(zhì)蛋白，而牙髓干細(xì)胞可低水平表達(dá)。LiuH等[10]指出，牙髓干細(xì)胞分化期間，初始階段膠原代謝相關(guān)基因、Runx2、TGFβ相關(guān)基因均上調(diào)且堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，后期均降低。此外，細(xì)胞外基質(zhì)磷糖蛋白是牙髓干細(xì)胞分化期間唯一降低標(biāo)記物。筆者認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)磷糖蛋白屬于礦化的抑制劑，其可以作為牙髓干細(xì)胞分化時(shí)下調(diào)的重要檢測(cè)指標(biāo)。劉少華等[11]在相關(guān)研究中以人根髓、冠髓細(xì)胞為觀察對(duì)象，分別提供組織塊法培養(yǎng)，結(jié)果顯示，根髓細(xì)胞的培養(yǎng)成功率較冠髓細(xì)胞高，并且其貼壁率、細(xì)胞活性、相同的增殖活性均較冠髓細(xì)胞優(yōu)，根髓細(xì)胞形態(tài)較冠髓細(xì)胞更加原始性，易誘導(dǎo)礦化。充分體現(xiàn)出牙髓干細(xì)胞存在全部牙髓中的可能性極高，牙髓干細(xì)胞根髓中的密度較冠髓中高。郭俊等[12]選用犬磨牙獲取牙髓，以組織塊法、酶消法取原代牙髓細(xì)胞，分析流式法、免疫熒光鑒定細(xì)胞蛋白表達(dá)，進(jìn)行牙本質(zhì)、成脂誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，兩組檢驗(yàn)法法均可獲取貼壁、集落生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞并穩(wěn)定增殖，成牙本質(zhì)誘導(dǎo)可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)，ALP、DSP陽(yáng)性，說(shuō)明犬健康年輕磨牙牙髓組織中可以穩(wěn)定分離出具有克隆能力的牙髓干細(xì)胞。

3 牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性情況分析

目前，和干細(xì)胞存在明確聯(lián)系的分子標(biāo)記較少，因此缺少干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，致使直接篩選干細(xì)胞的難度較高，加上髓干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志也較少，所以，多采用高度增殖與自我更新能力、多向分化能力等相關(guān)生物學(xué)特性對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn)[13-15]。

3.1高度增殖與自我更新能力 高度增殖能力是指牙髓干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的增殖率較骨髓基質(zhì)干細(xì)胞高，同時(shí)牙髓干細(xì)胞在傳代中同樣具有較高的增殖能力[16]。黃琬雪等[17]分析體外人乳牙牙髓干細(xì)胞與其聯(lián)合IL-6抗體對(duì)干燥綜合征患者外周血活化的CD4+T細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示出IL-6抗體的添加，有助于降低CD4+T細(xì)胞內(nèi)Th2比例，由此可知，體外人乳牙牙髓干細(xì)胞的應(yīng)用效果顯著，利于阻斷干燥綜合征患者CD4+T細(xì)胞的增殖；自我更新能力是指干細(xì)胞通過(guò)對(duì)稱或者不對(duì)稱分裂產(chǎn)生至少一個(gè)保留干細(xì)胞特性子細(xì)胞的過(guò)程，有助于維持干細(xì)胞的多分化潛能[18]。牙髓干細(xì)胞具有多向分化的潛能，在形成礦化結(jié)節(jié)能力的同時(shí)也可以在不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)下能夠分化成多種細(xì)胞系類型，如肝、神經(jīng)、骨、肌肉等，其有助于改善兔眼角膜缺損處，加速傷口愈合速度，也可替代受損肝細(xì)胞發(fā)揮抗炎、抗纖維化等功效，利于肝功能的恢復(fù)等[19]。劉南霞[20]等人以克隆化傳代法對(duì)犬牙髓干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，獲取多克隆來(lái)源細(xì)胞，同時(shí)檢驗(yàn)其克隆形成率，然后選用流式法對(duì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物予以鑒定，并在擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力、多向分化能力，結(jié)果顯示，克隆化傳代法的應(yīng)用，可以獲取犬牙髓干細(xì)胞（呈集落生長(zhǎng)），克隆形成率在20%～35%。此外，流式法鑒定結(jié)果得出STRO-1陽(yáng)性率為（14.7%）、 CD34為陽(yáng)性率（0.7%）、CD45陽(yáng)性率為（0.8%）。充分體現(xiàn)出克隆化分離培養(yǎng)的犬牙髓干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力、多向分化潛能。endprint

3.2多向分化能力 牙髓干細(xì)胞在不同因子誘導(dǎo)下可分化為中胚層細(xì)胞（成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等）、外胚層細(xì)胞（角膜上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等），具體分析如下：①向成骨細(xì)胞分化：史欣[21]等以礦化液培養(yǎng)DPSCs為觀察組、在此基礎(chǔ)上加入適量濃度OPN為對(duì)照組，均行茜素紅染色法，測(cè)定礦化結(jié)節(jié)的形成，分析骨源性基因（BSP、Runx-2、OCN、Col-1等）表達(dá)情況。結(jié)果得出，茜素紅染色法發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后，觀察組出現(xiàn)的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量、大小均較對(duì)照組高（P<0.05）。并且在OPN誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，兩組DPSCs骨源性基因表達(dá)呈陽(yáng)性，同時(shí)OPN組的骨源性基因（BSP、Runx-2、Col-1、OCN等）表達(dá)水平較對(duì)照組高（P<0.05），說(shuō)明骨橋蛋白可以促進(jìn)礦化液誘導(dǎo)DPSCs成骨分化能力的增強(qiáng)；②向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化：孫佳琦[22]等以體外培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，分別和硅化膠原、膠原材料進(jìn)行復(fù)合，建立細(xì)胞-支架復(fù)合體，加以礦化誘導(dǎo)液、常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，分析培養(yǎng)48 h、14 d、3周時(shí)在兩種膠原支架材料中人牙髓干細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)使用半定量PCR、實(shí)時(shí)定量PCR法分析兩種材料中DSPP、DMP-1、OCNmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，人牙髓干細(xì)胞在硅化膠原支架材料上的生長(zhǎng)情況類似于膠原材料，并且經(jīng)過(guò)硅化處理膠原支架材料，便于提高牙本質(zhì)再生相關(guān)基因（OCN、DSPP、DMP-1等）的表達(dá)水平，體現(xiàn)出膠原支架材料經(jīng)過(guò)硅化處理，利于人牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化；③向脂肪細(xì)胞分化：Lee[23-24]等人研究指出，病毒轉(zhuǎn)染的肽基脯氨?；?lè)串悩?gòu)酶PINI對(duì)DPSCs向脂肪細(xì)胞分化起到促進(jìn)作用，結(jié)果顯示，隨著脂滴的增多，成脂分化相關(guān)基因（過(guò)氧化物酶增生激活受體、脂肪酶和脂肪酸結(jié)合蛋白基因）表達(dá)水平也隨之增強(qiáng)，兩者呈正相關(guān)；④向神經(jīng)細(xì)胞分化：李雙月[25]等人以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）為研究對(duì)象，采用全骨髓貼壁法對(duì)其進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定，觀察其細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)增殖情況；以流式鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物；對(duì)第3代細(xì)胞提供RA、bF-GF、EGF聯(lián)合誘導(dǎo)，加以細(xì)胞免疫化學(xué)染色測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）表達(dá)。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)BMSCs呈成纖維細(xì)胞樣， 經(jīng)誘導(dǎo)后分化為神經(jīng)細(xì)胞，可以明顯表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志NSE，說(shuō)明BMSCs在誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)細(xì)胞，便于為日后移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供依據(jù)。

4 總結(jié)

經(jīng)過(guò)上述內(nèi)容分析，牙髓干細(xì)胞具有良好的分化潛能、自我更新能力、高度增殖能力等生物活性。此外，牙髓干細(xì)胞還具備良好的牙髓、牙本質(zhì)再生能力，所以，牙髓干細(xì)胞可以作為組織工程學(xué)中極具潛力的種子細(xì)胞?？梢?jiàn)，牙髓干細(xì)胞在組織生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)等方面取得了明顯的進(jìn)步，應(yīng)用前景十分廣闊。但是牙髓干細(xì)胞仍然面臨諸多問(wèn)題，如牙髓干細(xì)胞的高效率定向分化存在一定程度的困難；牙髓干細(xì)胞尚無(wú)特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物；牙髓干細(xì)胞存在形成腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)；牙髓干細(xì)胞隨著年齡的增長(zhǎng)，其組織修復(fù)能力降低；牙髓干細(xì)胞相關(guān)研究多數(shù)為人體外實(shí)驗(yàn)/動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，需要進(jìn)一步研究牙髓干細(xì)胞在疾病治療方面的影響等。相信隨著當(dāng)前臨床實(shí)踐研究的不斷深入，牙髓干細(xì)胞在今后組織工程領(lǐng)域得以發(fā)揮重大作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]王亦菁，張曉東，于華，等.體外成牙環(huán)境對(duì)牙髓干細(xì)胞和外胚間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，30（6）：579-583.

[2]王艷梅，木合塔爾·霍加，莊友梅，等.TGF-β3與牙髓干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兔面神經(jīng)損傷修復(fù)的作用[J].國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2012，35（3）：160-164，3-4.

[3]莊友梅，木合塔爾·霍加，許輝，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3和牙髓干細(xì)胞在兔面神經(jīng)損傷修復(fù)中作用[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2015，29（7）：637-639.

[4]董海波，李艷萍，牛玉梅，等.模擬微重力對(duì)人牙髓干細(xì)胞微絲及細(xì)胞遷移能力的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2012，28（7）：673-675.

[5]張紅梅，王永剛，張曉梅，等.脫礦牙本質(zhì)基質(zhì)對(duì)人牙髓干細(xì)胞體外增殖、牙向分化能力的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)，2012，32（3）：143-147.

[6]王曉航， 巴景斌.兩種乳牙根管填充劑的臨床療效比較[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2015， 40（4）：488-489.

[7]張曉莉.TGF-β3和牙髓干細(xì)胞修復(fù)損傷面神經(jīng)效果的檢測(cè)[D].新疆醫(yī)科大學(xué)，2013.

[8]胡資兵，曾榮，魏波，等.牙髓干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志，2014，24（9）：839-846.

[9]Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells（DPSCs）in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（25）：13625-13630.

[10]Liu H，Li W，Shi S，et al.MEPE is downregulated as dental pulp stem cells differentiate[J].Arch Oral Biol，2005，50（11）：923-928.

[11]劉少華，魏奉才，孫善珍，等.牙髓培養(yǎng)細(xì)胞特性與牙髓干細(xì)胞定位[J].上?？谇会t(yī)學(xué)，2004，13（2）：106-109.

[12]郭俊，賀露，楊健.犬牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（1）：99-103.

[13]王鈺瑩，運(yùn)慧媛，繆宏穎，等.成骨細(xì)胞與礦化液誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的對(duì)比研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，47（6）：364-368.endprint

[14]賈謙.堿性成纖維細(xì)胞因子對(duì)牙髓干細(xì)胞礦化能力影響及機(jī)制研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué)，2012.

[15]蔣文凱.牙髓干細(xì)胞克隆差異及其應(yīng)用于神經(jīng)和平滑肌再生方面的初步研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué)，2016.

[16]關(guān)麗娜.低氧環(huán)境下Notch信號(hào)通路對(duì)人牙髓干細(xì)胞増殖和分化的影響[D].第四軍醫(yī)大學(xué)，2015.

[17]黃琬雪，阮光峰，王艷青，等.人乳牙牙髓干細(xì)胞對(duì)干燥綜合征患者CD4+T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，38（1）：12-17.

[18]崔力.抑制瞬時(shí)受體電位M7通道表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移及成骨/成牙向分化的影響[D].南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

[19]李曉霞，方滕姣子，余湜，等.人乳牙牙髓干細(xì)胞在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2017，35（5）：533-537.

[20]劉南霞，程百祥，趙寅華，等.犬牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2013，29（3）：228-232.

[21]史欣，張鵬飛，孫玉芬，等.骨橋蛋白影響礦化液誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞成骨分化能力的研究[J].口腔醫(yī)學(xué)，2014，34（8）：566-569.

[22]孫佳琦，牛麗娜，沈麗娟，等.硅化膠原對(duì)人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化的影響[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2013，23（11）：700-704.

[23]Lee YM，Shin SY，Jue SS，et al.The role of PIN1 on odontogenic and adipogenic differentiation in human dental pulp stem cells[J].Stem Cells Dev，2014，23（6）：618-630.

[24]Lindemann D，Werle SB，Steffens D，et al.Effects of cryopreservation on the characteristics of dental pulp stem cells of intact deciduous teeth[J].Arch Oral Biol，2014，59（9）：970-976.

[25]李雙月，王哲敏，陳若霖，等.體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（1）：7-10.

收稿日期：2017-10-30；修回日期：2017-11-14

編輯/成森endprint