基于空間阻滯的新型高靈敏電化學(xué)傳感器檢測(cè)三磷酸腺苷的研究

邵爽

摘 要 構(gòu)建了檢測(cè)ATP的新型高靈敏電化學(xué)傳感器，采用掃描電鏡、熒光顯微鏡成像技術(shù)、微分脈沖伏安法及電化學(xué)阻抗法進(jìn)行表征。傳感器以硅納米顆粒通過多段DNA鏈與氧化鋁納米孔膜形成的三明治結(jié)構(gòu)阻礙離子傳導(dǎo)， ATP存在下，傳感器中的三明治結(jié)構(gòu)被破壞，使離子通道順暢，通過檢測(cè)其電流變化值達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)物ATP的目的。硅納米顆粒的應(yīng)用提高了檢測(cè)靈敏度，降低了背景信號(hào)；而且僅需極少量的樣品即可實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的檢測(cè)。結(jié)果表明，此傳感器對(duì)ATP檢測(cè)的線性范圍為0.025～0.900 nmol/L，檢出限為13 pmol/L（S/N=3）。當(dāng)樣品中有100倍目標(biāo)物濃度的共存物質(zhì)存在時(shí)，傳感器仍顯示出對(duì)ATP的高特異性。此傳感器構(gòu)建簡(jiǎn)單，再生性好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠血液中痕量ATP的檢測(cè)，有望應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、醫(yī)藥工業(yè)和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞 三磷酸腺苷； 氧化鋁納米孔膜； 硅納米顆粒； 生物傳感器

1 引 言

三磷酸腺苷（Adenoine triphosphate， ATP）是一種多用途化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)劑，在生命體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也起著中心作用。此外ATP在環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物分析以及生命科學(xué)等領(lǐng)域也具有重要作用[1～3]。目前，檢測(cè)ATP的方法主要有比色法[4，5]、液相色譜法[6]、熒光分析法[7～9]、化學(xué)發(fā)光法[10]和電化學(xué)方法[11]等。Liu等[12]利用硫磺素（ThT）的熒光增敏效應(yīng)設(shè)計(jì)了可靈敏檢測(cè)ATP的方法，Chen等[13]利用納米金聚集性能建立了測(cè)定ATP的比色方法。在目前所使用的方法中，實(shí)驗(yàn)操作繁雜、所用試劑制備困難、需要昂貴的儀器等缺點(diǎn)限制了方法應(yīng)用。近年來，納米孔作為一種能與適配體聯(lián)用并具有智能響應(yīng)的納米器件在生物分析領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，在提高檢測(cè)方法的靈敏度及特異性方面有顯著優(yōu)勢(shì)。

本研究將具有高特異性的適體與具有智能響應(yīng)的氧化鋁納米孔膜（PAA）相結(jié)合構(gòu)建生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠血液樣品中痕量ATP的高靈敏、高選擇性檢測(cè)。傳感器工作原理如圖1所示，首先，在PAA孔道內(nèi)修飾能與ATP適體（H4）3′端部分互補(bǔ)的核苷酸鏈（H1），在二氧化硅納米粒子（SiO2NPs）上修飾可與H4鏈5′端部分互補(bǔ)的核苷酸鏈（H2）。在H4存在下，PAA/H1和H2/SiO2NP可在PAA孔道內(nèi)形成具有三明治結(jié)構(gòu)的PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs復(fù)合體。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI832電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）； IX51奧林巴斯倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。氧化鋁納米孔膜（PAA， 直徑25 mm，厚度為60 μm，孔徑為200 nm，上海上木科技有限公司）。3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、三氯乙酸（TCA）、三磷酸腺苷（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）、三磷酸鳥苷（GTP）、三磷酸尿苷（UTP）、二磷酸腺苷（ADP）和腺苷單磷酸（AMP）等購于國藥集團(tuán)有限公司（上海）。核苷酸序列：H1：5′NH2TTTT TTTTTTTTTTTCTTCCTCCGC3′，H2：5′ACTCCCCC AGTTTTTTTTTTNH23′， H3：5′6（FAM）ACTCCCCC AGTTTTTTTTTTNH23′，ATP適體 H4：5′CTGGGGG AGTATTGCGGAGGAAG3′，均經(jīng)HPLC純化并由上海生工有限公司合成。所用試劑均為分析純，TrisHCl緩沖液（15 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2和10 mmol/L TrisHCl， pH=7.4），實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（超純水儀，上海純浦實(shí)業(yè)有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 H2/SiO2NPs的合成 單分散性的二氧硅納米粒子（SiO2NPs）采用文獻(xiàn)[14]的溶膠凝膠法合成，濃度約0.5 g/L。 在5 mL SiO2NPs乙醇分散液中加入60 μL APTES、 5 mL 1.05%丁二酸酐DMF溶液，室溫?cái)嚢?4 h后，懸浮于10% DMSO pH 7.4緩沖液中，加入6.0 nmol H2或H3、 0.02 g EDC，37℃水浴中振蕩過夜，離心、洗滌，分散于200 μL TrisHCl緩沖液，濃度約為0.25 g/L。

2.2.2 PAA/H1修飾電極的制備 PAA電極浸入含有25%APTES的丙酮溶液，持續(xù)5 h，乙醇和水交替沖洗后，置于2.5%戊二醛溶液中，避光孵育過夜；洗滌后浸入1 mL含100 nmol/L H1、 0.1 g EDC和25% DIPEA 的TrisHCl緩沖液中， 37℃恒溫振蕩孵育過夜，取出后用TrisHCl緩沖液洗滌， 除去游離的H1， 得到H1修飾的PAA電極。

2.2.3 PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs傳感器的制備 將上述PAA/H1置于1 mL含100 nmol/L H4， 0.025 g/L H2/SiO2NPs TrisHCl緩沖液中， 37℃下孵育1 h，洗滌后，于4℃、飽和濕度下保存，備用。

2.2.4 小鼠血樣中ATP的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16，17]進(jìn)行血樣預(yù)處理：取30 μL SD大鼠新鮮血液，稀釋1倍， 加入6 μL 4.9 mol/L三氯乙酸（TCA）溶液破壞血紅細(xì)胞壁釋放ATP，再加入24 μL TrisHCl緩沖液， 使最終體積為90 μL， 混勻， 在冰浴中反應(yīng)5 min。2500 r/min離心5 min，取30 μL上清液滴加到傳感器表面，于37℃下密閉孵育1 h，傳感器用TrisHCl緩沖液清洗后， 再置于4.0×10 4 mol/L K3Fe（CN）6溶液中，在0～0.4 V范圍做微分脈沖伏安掃描（DPV），記錄掃描氧化峰電流值。

3 結(jié)果與討論

3.1 H2/SiO2NPs的表征

SiO2NPs呈球形， 并顯示出良好的單分散性，其直徑約40 nm（圖2A）。熒光顯微鏡觀察FAMH3至SiO2NPs表面修飾情況見圖2B和2C，只有納米粒子表面才有綠色熒光出現(xiàn)，表明硅納米粒子表面成功修飾了DNA鏈。endprint

3.2 傳感器的電鏡表征

PAA孔徑約200 nm，表面較光滑（圖2D），當(dāng) PAA修飾H1鏈時(shí)，PAA納米孔壁及周圍變得粗糙（圖2E），表明H1修飾到PAA納米孔內(nèi)壁；進(jìn)一步修飾H2/SiO2NPs后，PAA納米孔內(nèi)及其周圍區(qū)域都覆蓋有準(zhǔn)圓形顆粒（圖2F），證明H2/SiO2NPs成功修飾到PAA膜納米孔內(nèi)壁，形成了 PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs三明治結(jié)構(gòu)， 可堵塞PAA通道。

電極表面修飾PAA后，其阻抗圖中高頻區(qū)的半圓直徑（大小相當(dāng)于電子轉(zhuǎn)移阻抗Ret）很小（圖3B），依次在PAA膜孔內(nèi)壁修飾氨基、羧基、H1鏈及形成PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs三明治復(fù)合物后，Ret逐漸增加，這是由于空間位阻效應(yīng)及電子排斥效應(yīng)導(dǎo)致，上述結(jié)果再次表明傳感器成功層層組裝和修飾。

傳感器置于適量ATP溶液孵育后，將剩余ATP量的對(duì)數(shù)值與培育時(shí)間作圖可得一條直線（圖3C）。95%置信度時(shí)，其直線方程為lnCATP = 0.0257t （min）-3.790（R2=0.9763），呈一級(jí)反應(yīng)性質(zhì)。這是因?yàn)榕cPAA通道內(nèi)的三明治PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs復(fù)合物相比，加入的目標(biāo)物ATP 量很少，因此 ATP與SiO2NP三明治復(fù)合物的反應(yīng)表現(xiàn)為準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)，通過計(jì)算可得此置換反應(yīng)的速率常數(shù)k=4.28×10，說明其反應(yīng)速度可以滿足快速檢測(cè)ATP的需求。

3.5 傳感器特異性和再生性實(shí)驗(yàn)

傳感器的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A所示。當(dāng)CTP、GTP、UTP、ADP和AMP的濃度分別是ATP濃度的100倍時(shí)，傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)很低；只有當(dāng)ATP存在或樣品中同時(shí)含有ATP時(shí)，其電化學(xué)響應(yīng)增大。說明此傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的特異性檢測(cè)。

由于傳感器的組裝和修飾步驟比較繁雜，傳感器的重復(fù)利用有利于降低成本。對(duì)傳感器的再生性能做了研究。即檢測(cè)ATP后，傳感器為PAA/H1狀態(tài)，可繼續(xù)與H2/SiO2NPS及H4作用，使之形成完整的三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合體（PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs），回到傳感器初始狀態(tài)，可再重復(fù)進(jìn)行ATP檢測(cè)操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4B，傳感器在檢測(cè)再生的8次循環(huán)使用中，其電化學(xué)信號(hào)呈周期性變化，檢測(cè)電流改變值小于10%。因此，所制備的傳感器具有良好的再生性。

3.6 傳感器對(duì)ATP的檢測(cè)性能

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，在傳感器表面分別滴加30 μL不同濃度的 ATP溶液，密閉孵育后的檢測(cè)結(jié)果如圖5A所示。在0.025～0.900 nmol/L范圍內(nèi)，檢測(cè)信號(hào)與ATP濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y（μA）=0.331CATP （nmol/L） +0.0110（R2=0.9917），檢出限為13 pmol/L（S/N=3）。由于測(cè)定時(shí)所需樣品溶液體積僅為30 μL，因此最低檢測(cè)量?jī)H為2.2 pg，表明此傳感器所用樣品量少，靈敏度高。

3.7 生物樣品中ATP檢測(cè)

為驗(yàn)證此ATP傳感器在檢測(cè)生物實(shí)際樣品中ATP的實(shí)用性，檢測(cè)了稀釋的SD大鼠全血樣品、TCA處理后的SD大鼠全血稀釋樣和SD大鼠血漿稀釋樣中的ATP，結(jié)果見表1。在血漿稀釋樣和全血稀釋樣中都未檢出ATP，僅在TCA處理后的全血稀釋液中檢測(cè)出ATP，通過計(jì)算可得原SD大鼠血樣中ATP 濃度為0.43 nmol/L，加標(biāo)回收率在94.5%～105.8%范圍內(nèi)，表明本傳感器可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

4 結(jié) 論

基于空間阻滯構(gòu)建了新型生物傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)ATP的靈敏/高效檢測(cè)。采用硅納米粒子和氧化鋁納米孔膜組成的三明治結(jié)構(gòu)，最大限度地調(diào)控PAA膜納米通道內(nèi)的離子移動(dòng)性能，有效降低傳感器背景信號(hào)及檢測(cè)用量，檢出限達(dá)到13 pmol/L，并且所需的樣品量極少（30 μL），可極大地提高檢測(cè)靈敏度。傳感器還具有良好的再生性能，可降低使用成本。傳感器可實(shí)現(xiàn)生物樣品中ATP的檢測(cè)，回收率均在94.5%～105.8%范圍內(nèi)，表明方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性高。此傳感器有望在臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域應(yīng)用。

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Abstract In this work， a highly sensitive electrochemical biosensor for the detection of trace adenosine triphosphate （ATP） was proposed. The biosensor was based on porous anodic alumina （PAA） and SiO2 nanoparticles combining with several oligonucleotides to construct sandwich structure. It was characterized by scanning electron microscopy， fluorescence microscopy， differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy， which conformed to the reliability of the biosensor fabrication and the feasibility of the detection. In the presence of ATP， the sandwich structures could be destroyed. The variation of the current was directly corresponding to the amount of the ATP. The application of SiO2 nanoparticles could effectively reduce the background and increase the sensitivity of the biosensor. The calibration curve of ATP was obtained in the range of 0.025-0.900 nmol/L with the detection limit of 13 pmol/L （S/N=3）. Also， the biosensor exhibited a good specificity. Besides， the sensor was constructed easily and possessed excellent regeneration ability. The proposed biosensor was applied in detection of real sample such as mice blood. Therefore， the proposed ATPsensing biosensor could be expected to be applied in clinical， pharmaceutical and environmental detection.

Keywords Adenosine triphosphate； Porous anodic alumina； Silicon dioxide nanoparticles； Biosensors

（Received 2 November 2017； accepted 8 December 2017）

This work was supported by the Nation Key Foundation for Exploring Scientific Instrument （No.2011YQ150078）， the Science and Technology Commission of Shanghai （No.15142200600）， and the National Natural Science Foundation of China （No.21575024）.endprint