4種消毒劑對氣單胞菌的抑菌殺菌效果研究

文/韋 艷 李傳慰 祭仲石

本文以2016年本地區(qū)的一個生產(chǎn)周期為例，本實驗室分離到的氣單胞菌為實驗對象，選擇本地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常用的復合碘、苯扎溴銨、戊二醛和二硫氰基甲烷四種消毒劑為實驗用消毒劑，采用二倍稀釋法，檢驗各消毒劑的體外抑菌殺菌效果。結(jié)果表明，幾種消毒劑中，抑菌殺菌效果依次為：二硫氰基甲烷＞苯扎溴銨＞ 復合碘＞戊二醛。通過本文的研究，以期為本地區(qū)淡水養(yǎng)殖找到合理高效的消毒劑提供依據(jù)。筆者就2016年度4種消毒劑對氣單胞菌的體外抑菌殺菌效果研究的情況介紹如下，供大家參考。

氣單胞菌屬于γ－變形菌綱、氣單胞菌目、氣單胞菌科、氣單胞菌屬（Aeromonas），包括嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）、維氏氣單胞菌（A.veronii）等20種。很多種氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種疾病的病原菌，在自然水體與養(yǎng)殖水體中廣泛存在，在池塘水質(zhì)惡化和養(yǎng)殖對象體質(zhì)下降時，往往會加重疾病的誘發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來重大損失。氣單胞菌是一種重要的淡水養(yǎng)殖病原菌，可感染許多種水產(chǎn)動物，其中最嚴重的是以細菌性敗血癥為主，該病爆發(fā)迅速，一旦爆發(fā)往往造成巨大的損失。目前魚類的細菌性疾病的治療還是依靠內(nèi)服抗生素，但是，抗生素的大量使用容易產(chǎn)生耐藥菌株，同時抗生素在魚體內(nèi)殘留也導致了食品安全問題。而化學類消毒劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛應用，可以有效的消滅病原微生物，起到了防治細菌性疾病的效果，且通常不會產(chǎn)生殘留問題，因此尋找廣譜、高效的外用消毒藥物顯得迫在眉睫，市場上消毒劑種類繁多，良莠不齊，選擇合理的消毒劑可以有效減少盲目用藥帶來的損失，增加經(jīng)濟收益。

一、材料與方法

（一）材料

實驗用消毒劑購自當?shù)厥袌?；培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基，p H（7.4±0.2），采購自O(shè)XOID；實驗用氣單胞菌菌株BY-1分離自當?shù)鼗疾■~。

（二）實驗方法

1.細菌的分離與純化

按無菌操作方法，分別取患病鳊魚的肝臟、腎臟部位劃線分離到腦心浸液培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，挑取優(yōu)勢菌落進行純化，劃線接種于腦心浸液培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h。

2.細菌懸濁液的制備

將分離到的致病菌接種于腦心浸液培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后挑選優(yōu)勢菌落純化培養(yǎng)，然后經(jīng)純化培養(yǎng)后接種于斜面培養(yǎng)基，再次置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后用0.7%的生理鹽水洗下菌苔，制成細菌懸濁液為0.5麥氏單位備用。

3.4種消毒劑對氣單胞菌最小抑菌濃度（MIC）測定

試驗步驟：將4種消毒劑分別用蒸餾水稀釋為1000mg/L的母液，然后用濾菌器將4種消毒劑濾菌，采用二倍稀釋法，使液體培養(yǎng)基中4種消毒劑含量分別達到512mg/L、256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L。再分別接種100μL菌液濃度約為108CFU/mL的細菌懸濁液作為試驗組；陽性對照將菌接種于不含4種消毒劑的腦心浸液液體培養(yǎng)基的試管中，陰性對照不加菌液。30℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。通過細菌的是否生長，確定4種消毒劑抑制受試菌生長的最低濃度。

評定方法：當陽性對照管有細菌生長（渾濁），陰性對照管無細菌生長（澄清），試驗組中無菌生長的最低4種消毒劑的濃度即為4種消毒劑對該供試菌株的MIC。

4.4種消毒劑對氣單胞菌最小殺菌濃度（MBC）測定

試驗步驟：根據(jù)最小抑菌濃度結(jié)果，分別選擇高于MIC5個稀釋度的試管中的培養(yǎng)液，取100μL菌液接種于相應的液體培養(yǎng)基中，同時添加陽性對照和陰性對照，30℃恒溫條件下培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

評定方法：當陽性對照管中有細菌生長（渾濁），陰性對照組無細菌生長（澄清），試驗組無菌生長的最低稀釋度所對應的消毒劑濃度為該樣品對受試菌的MBC。

二、結(jié)果分析

（一）幾種消毒劑的最小抑菌濃度（MIC）

肉眼觀察無致病菌生長試管中的最低藥物濃度，即為該供試藥物的MIC。各菌株在含有不同濃度消毒劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，結(jié)果見表1。由表1中可以看出，陽性對照試管內(nèi)出現(xiàn)渾濁，表示細菌增殖良好，陰性對照試管內(nèi)澄清，表示沒有細菌生長。實驗組各試管出現(xiàn)渾濁和澄清現(xiàn)象，表明不同的消毒劑可以在不同濃度下抑制氣單胞菌的生長。

從表1中可以得知各消毒劑對氣單胞菌的最小抑菌濃度（MIC），其中二硫氰基甲烷在1mg/L時出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，表示在該濃度下不能抑制細菌生長，而在濃度2mg/L及以上濃度時出現(xiàn)透澄清現(xiàn)象，表明該濃度下細菌的生長被抑制，表明二硫氰基甲烷的最小抑菌濃度（MIC）是2mg/L。戊二醛在64mg/L及該濃度以下時均出現(xiàn)渾濁，表明在該濃度以及該濃度以下不能抑制細菌生長，而在濃度為128mg/L時及該濃度以上時均出現(xiàn)澄清現(xiàn)象，表明該濃度下細菌的生長被抑制，由此可得知，戊二醛的最小抑菌濃度（MIC）是128mg/L。同理可得出復合碘的最小抑菌濃度（MIC）是64mg/L，苯扎溴銨的最小抑菌濃度（MIC）是4mg/L。

以上幾種消毒劑的MIC實驗結(jié)果表明：二硫氰基甲烷在較低濃度下就可以有效抑制氣單胞菌的生長，由此說明在養(yǎng)殖過程中，使用二硫氰基甲烷類消毒劑可以有效抑制致病菌的生長繁殖。

表1 4種消毒劑對氣單胞菌的抑制作用

（二）幾種消毒劑的最小殺菌濃度（MBC）

MBC即為供試藥物殺滅99.9%或以上受試致病菌所需要的最低濃度。具體操作步驟是：在各消毒劑最小抑菌濃度實驗的基礎(chǔ)上進行測定，分別選擇高于各消毒劑最小抑菌濃度的5個稀釋度試管中的培養(yǎng)液，各取100μL菌液接種于對應的液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫條件下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。表2表明，各陽性對照菌出現(xiàn)渾濁，說明細菌可以生長繁殖；陰性對照出現(xiàn)澄清現(xiàn)象，說明陰性對照試管中沒有細菌增殖；實驗組各組試管中出現(xiàn)不同程度的渾濁或澄清。氣單胞菌在二硫氰基甲烷濃度8mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明二硫氰基甲烷在2mg/L～8mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌；氣單胞菌在苯扎溴銨濃度32mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明二苯扎溴銨在4mg/L～32mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌；氣單胞菌在戊二醛512mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明戊二醛在128mg/L～512mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌；氣單胞菌在復合碘濃度512mg/L以下時出現(xiàn)渾濁，說明復合碘在64mg/L～512mg/L時只抑制了氣單胞菌的增殖，沒有殺滅氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌

表2 4種消毒劑對氣單胞菌的抑制作用

三、討論

氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌，是淡水養(yǎng)殖中細菌性敗血癥的主要病菌，快速準確的對其進行鑒定、篩選高效的消毒劑，對及時采取措施控制病情，指導養(yǎng)殖業(yè)科學用藥，對實現(xiàn)水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖、保障食品安全具有重要意義。篩選高效的消毒劑，可以有效控制細菌性疾病，減少大量死亡帶來的損失，增加養(yǎng)殖收入。本實驗選擇了4種常用的消毒劑進行研究，研究結(jié)果表明：4種消毒劑效果依次為：二硫氰基甲烷>苯扎溴銨>復合碘>戊二醛。二硫氰基甲烷對氣單胞菌的抑菌效果最好，MIC為2mg/L，MBC為8mg/L，而戊二醛和復合碘效果相對較差。譚鳳霞等研究表明，戊二醛在濃度為7.8mg/L 時對氣單胞菌有有較好的抑菌效果，在相對高濃度的125mg/L的濃度下，對氣單胞菌具有殺滅作用。譚鳳霞等還研究表明，聚維酮碘對氣單胞菌的MIC在125.00mg/L～250.00mg/L，MBC在4.00g/L～8.00g/L。本文結(jié)果表明，戊二醛MIC和MBC分別為128mg/L和大于512mg/L；復合碘MIC和MBC分別為64mg/L和大于512mg/L。本文結(jié)果與其他研究有些許不同，可能由于不同養(yǎng)殖區(qū)域慣用的消毒劑和環(huán)境不同，導致氣單胞菌的耐藥性不同，從而導致了不同地區(qū)氣單胞菌的耐藥性有所不同。

本文結(jié)果表明，二硫氰基甲烷在較低濃度下可以有效抑制和殺滅嗜水氣單胞菌，其效果明顯優(yōu)于戊二醛、聚維酮碘等消毒劑。但不同地區(qū)的細致病菌存在不同的耐藥性，且市場上消毒劑種類繁多，質(zhì)量良莠不齊，選擇合理的消毒劑可以有效減少盲目用藥帶來的損失，在今后的工作中，還要再進行同種類型消毒劑的橫向比較，挑選最優(yōu)藥物。希望本文結(jié)果可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用消毒劑提供一定的參考。