高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留

葉佳明，王 京，鐘世歡，詹越城，楊 琳，陳青俊

（1.浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009；2.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310009）

0 引言

豆芽是日常生活中一種價廉物美的食品，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、B族維生素和微量元素，營養(yǎng)價值豐富且易于被人體消化吸收[1]。近年來，問題豆芽屢有報道，主要由一些小作坊在生產(chǎn)過程中違法添加植物生長激素所致，其中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、吲哚乙酸、吲哚丁酸、1-奈乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、4-氟苯氧乙酸等[2]。這些植物生長調(diào)節(jié)劑的主要作用是促進豆芽生長、抑制長根和提高產(chǎn)量，長期食用含過量植物生長調(diào)節(jié)劑的食品會對人體造成積蓄危害[3]。

目前，針對豆芽中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、拉曼光譜法[4]、離子色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[5]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （GC-MS/MS）[3]、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[6-8]。高效液相色譜法和氣相色譜法靈敏度低、易受干擾，拉曼光譜法和離子色譜法使用范圍窄，氣相色譜-質(zhì)譜法與氣質(zhì)聯(lián)用法前處理要求高、樣品基質(zhì)干擾大，吲哚乙酸與吲哚丁酸回收率低[3]。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法因其特異性強、靈敏度高、定性能力好，廣泛應(yīng)用于各種禁限用物質(zhì)的檢測。

試驗根據(jù)豆芽生長激素的化學(xué)性質(zhì)，采用1%酸化乙腈溶液提取，以HLB柱凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆芽中6種生長調(diào)節(jié)劑，方法簡單、快速、高效。

1 試驗部分

1.1 試驗儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent 6460型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、AR2140型電子分析天平、IKAVORTEXGENIU3型渦旋混合器、TGL-16G型臺式離心機、KS-300EI型超聲波儀，氮吹儀。

甲醇（色譜級），乙腈（色譜級），4-氯苯氧乙酸（Sigma，純度98%），4-氟苯氧乙酸（Certificate，純度98%），6-芐基腺嘌呤（Dr.Ehrenstrfer，純度99%），赤霉素（Dr.Ehrenstrfer，純度99%），吲哚乙酸（Dr.Ehrenstrfer，純度99%），吲哚丁酸（Dr.Ehrenstrfer，純度99%），OasisMAX固相萃取柱（60mg/3mL，3 μm），Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm），QuECh-ERS粉末（含300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18和100 mg PSA）。

6種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取10.0mg的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100 mL，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，使用時用空白基質(zhì)提取液配置成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 試驗方法

（1） 提取。稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 1%酸化乙腈溶液，2 g氯化鈉，渦旋1 min后，超聲提取20 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，收集上清液，沉淀加入15 mL 1%酸化乙腈溶液重復(fù)提取1次，合并2次提取液。

（2） 凈化。①取4 mL提取液置于QuEChERS離心管（含300mg無水硫酸鎂和100 mg C18和100 mg PSA） 中，渦旋混合2 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，移取全部上清液于15 mL離心管中，于40℃下氮氣吹干，加入1 mL流動相定容，過0.22 μm濾膜后，待測。②取2 mL提取液40℃下氮吹，加入3 mL蒸餾水溶解后過HLB小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，用3 mL水淋洗，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液40℃下氮氣吹干，加入1 mL流動相定容，過0.22 μm濾膜后，待測。③取2 mL提取液過MAX小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，依次用3 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉水溶液，3mL甲醇淋洗，用3 mL 1%甲酸甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃下氮氣吹干，加入1mL流動相定容，過0.22 μm濾膜后，待測。

（3）色譜條件。色譜柱：Agilent SB C18，RRHD 1.8 μm，2.1×100 mm；流動相：0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈，梯度洗脫條件見表1；流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進樣量5 μL。

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

（4）質(zhì)譜條件。電噴霧ESI離子源：6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸采用正離子掃描模式；4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素采用負離子掃描模式；多反應(yīng)檢測模式（MRM）。

質(zhì)譜離子源參數(shù)見表2，MRM質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表2 質(zhì)譜離子源參數(shù)

表3 MRM質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

對6種化合物進行正負離子模式全掃描，結(jié)果顯示4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素結(jié)構(gòu)中含有羧基，在負離子模式下有較高響應(yīng)，吲哚乙酸、吲哚丁酸結(jié)構(gòu)中有氨基和羧基同時存在，6-芐基腺嘌呤有氨基存在，正負離子模式下均有響應(yīng)，但正離子模式下響應(yīng)遠高于負離子模式，因此，6芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸采用正離子模式，4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素采用負離子模式。通過全掃描方式得到6種化合物的母離子（m/z），針對母離子（m/z）的裂解電壓進行優(yōu)化，得到最佳的裂解電壓。通過母離子碰撞掃描發(fā)現(xiàn)2對具有較高的豐度子離子，分別作為定性離子定量離子。在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下，對定性定量離子碰撞能進行優(yōu)化，得到各自最佳的碰撞能。優(yōu)化離子源的霧化器壓力、干燥氣溫度和流速等參數(shù)詳見表2，最終確定離子源的霧化器壓力45 psi，干燥氣溫度350℃，流速10 L/min。

2.2 色譜條件的選擇

流動相對目標(biāo)物的峰形、靈敏度及分離度也有較大的影響。試驗以Agilent SB C18柱分離目標(biāo)化合物，以乙腈作為有機相進行洗脫，分別考查水、0.1%甲酸水，0.05%氨水，5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）作為水相對6種化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，酸性條件下，對負離子電離產(chǎn)生抑制，在堿性條件下，對正離子電離產(chǎn)生抑制，以5 mmol/L醋酸銨水溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作為流動相時，6種目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)值理想，峰形很好。這是因為流動相的離子強度介質(zhì)中更有利于離子化。因此，選用0.1%甲酸5 mmol/L醋酸銨水溶液和乙腈作為流動相。

6種生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)MRM圖（4 ng/mL）見圖1。

圖1 6種生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)MRM圖（4 ng/mL）

2.3 提取方式的選擇

豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑多殘留的提取溶劑主要有甲醇和乙腈，使用乙腈作為提取溶劑，能保證目標(biāo)物提取效率的同時，還能沉淀蛋白降低提取液中的基質(zhì)效應(yīng)。6-芐基腺嘌呤、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸不溶于水，提取液中加入2 g氯化鈉，可以將水與乙腈分層，4-氯苯氧乙酸和4-氟苯氧乙酸常以4-氯苯氧乙酸鈉和4-氟苯氧乙酸鈉形式存在，易溶于水和堿性水溶液，加入0.1%甲酸酸化后，易溶于乙腈、乙醚等有機試劑。因此，提取溶劑選用0.1%酸化乙腈。

2.4 凈化方式的選擇

液液萃取法、QuEChERS法、固相萃取小柱法等是常用凈化的手段，豆芽基質(zhì)復(fù)雜，待測物化學(xué)性質(zhì)差別較大，單靠液液萃取法無法起到凈化的效果。已有文獻采用QuEChERS法（分散固相萃取法）[6-9]來進行預(yù)處理，QuEChERS法簡單快速。但加入的無水硫酸鎂和乙酸鈉粉末在去除水的同時，也會吸附少部分目標(biāo)化合物，常用的吸附劑PSA(N-丙基乙二胺)、C18、GCB（石墨化炭黑）吸附機理不同，除雜效果也有差異；HLB、MCX、MAX是常用的3種凈化小柱，根據(jù)試驗發(fā)現(xiàn)HLB、MAX小柱能起到凈化效果，MCX柱只對6-芐基腺嘌呤有保留，其他物質(zhì)因其帶有羧酸基團不適用，試驗比較了QuEChERS法、HLB凈化小柱和MAX復(fù)合陰離子交換小柱凈化效果。

3種凈化方式標(biāo)物回收率比較見表4。

表4 3種凈化方式標(biāo)物回收率比較/%

QuEChERS法6種化合物的回收率為63.8%～98.9%，HLB小柱凈化后6種化合物回收率均為90%以上，MAX凈化小柱對6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素回收率均在95%以上，但對4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸無保留，結(jié)合實際樣品測定，發(fā)現(xiàn)QuEChERS法處理后，樣品基質(zhì)效應(yīng)比較強，C18與PSA粉末對赤霉素有一定的吸附，為保證回收率要控制C18與PSA粉末的加入量。MAX小柱對6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素凈化效果好，對4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸無保留，是由于4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸與MAX填料吸附弱，在甲醇淋洗過程中被洗脫，HLB小柱回收率高，對6種化合物均適用，因此采用HLB小柱作為凈化手段，實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)上樣量過大后會造成回收率下降，是由于柱飽和后過載，因此選用HLB小柱作為凈化手段時要控制上樣量。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

選取陰性樣品，按照相同方法進行前處理，配置基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種化合物的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度依次為 0.1，2.0，4.0，8.0，20.0，40.0 ng/mL，以化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表5。

6種化合物在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，線性良好，以3倍信噪比計算各物質(zhì)檢出限如表5所示，均小于國家食品藥品監(jiān)督管理總局食品補充檢驗方法的公告（2017年第24號）附件3豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定中規(guī)定的檢出限5 μg/kg，能滿足日常檢驗要求。

表5 6種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.6 精密度與回收率

選取黃豆芽、綠豆芽陰性樣品作為空白基質(zhì)，分別添加1.0，5.0，10.0 μg/kg 3種不同水平進行加標(biāo)回收試驗，按試驗方法進行處理，平行測定6份。

表6 精密度和回收率

精密度和回收率見表6。

黃豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率在79.8%～95.6%，RSD＜5.69%，綠豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率為80.9%～94.1%，RSD＜6.66%。因此，此方法適用于豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑的測定，精密度和回收率符合檢測要求。

2.7 實際樣品的檢測

采用此方法對從市場上抽取的20批次黃豆芽、綠豆芽樣品進行檢測，其中6-芐基腺嘌呤有12批次檢出，含量為0.5～18.5 μg/kg，均小于GB/T23381—2009食品中6-芐基腺嘌呤測定高效液相色譜法規(guī)定的檢出限20 μg/kg；吲哚乙酸有4批次檢出，含量為3.0～12.0 μg/kg；4-氯苯氧乙酸有9批次檢出，含量為10.5～780 μg/kg；其他化合物殘留量較低，均未檢出。

3 結(jié)論

依據(jù)豆芽生長激素化學(xué)性質(zhì)，建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測方法，該方法通過對前處理過程和色譜質(zhì)譜的條件優(yōu)化，較好地控制了基質(zhì)干擾，靈敏度高、重現(xiàn)性好、抗干擾能力強，適用于豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的檢測，也為其他類似物質(zhì)殘留的檢測提供了參考。

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