茂名地區(qū)柑橘黃龍病內生菌檢測的初步分析

陳汝琪，呂美影，馬超

（廣東石油化工學院生物工程系，廣東茂名 525000）

我國是世界第一大柑橘生產國，2009年柑橘栽培面積已超過215.2萬公頃，總產量達到256萬噸[1]。目前，影響柑橘產業(yè)發(fā)展最重大的問題是柑橘黃龍病，在我國大部分的柑橘種植地區(qū)，黃龍病的危害情況已不容樂觀。目前認為，黃龍病是由難以人工培養(yǎng)的革蘭氏陰性細菌引起，其寄生于柑橘枝條韌皮部，屬于α-變形菌綱的候選韌皮桿菌屬，該病菌的寄主范圍廣泛，主要寄生于柑橘屬以及草本非蕓香科植物[2]。

柑橘植株感染黃龍病后，有一定時間段的潛伏期。發(fā)病早期，葉片出現(xiàn)斑駁黃化、黃梢和不轉綠等癥狀，如圖1所示。同其他植物體一樣，柑橘組織器官內也存在著豐富的內生細菌資源，通過從橘品種中分離出內生細菌，并發(fā)現(xiàn)了多種具有拮抗作用的內生細菌[3]，分離及篩選能夠抵抗柑橘黃龍病的內生細菌是減少黃龍病對柑橘果樹的危害的一條有效途徑。

圖1 患黃龍病柑橘葉片

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

患黃龍病柑橘葉片，來自信宜市鄉(xiāng)鎮(zhèn)的柑橘果園；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），AR；引物OI1/OI2由上海生物工程公司合成。

1.2 儀器

Box F3型凝膠成像系統(tǒng)；ABIVeriti96型基因擴增儀；BSP型生化培養(yǎng)箱；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機。

1.3 柑橘內生菌的分離純化

柑橘內生細菌的分離參照梁盛年等[4]的方法，略作修改。

1.4 內生細菌的分類鑒定

挑取純培養(yǎng)的內生菌制片，對其進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察內生菌的菌落形態(tài)。

1.5 柑橘內生菌DNA的提取及PCR鑒定

將分離純化后的內生細菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上，搖床37℃擴大培養(yǎng)16～18 h。隨后用菌液提取內生菌DNA。

柑橘內生菌DNA的提取參考劉小勇等[5]的方法，略作修改。

內生菌16SrDNA的PCR擴增選用細菌通用引物：正向引物799F和反向引物1492R，序列如下：

799F：5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'

1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'

PCR擴增體系為25 μL，即10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，上、下游引物各 2 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，MgCl21.5 μL，ddH2O補至25 μL。

PCR擴增程序為94℃、3 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、45 s，35 個循環(huán)；72℃、7 min。PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結束后于凝膠成像儀中觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 表面消毒效果

將空白培養(yǎng)基平板和涂布了柑橘葉片最后一次無菌水沖洗液的培養(yǎng)基平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱上培養(yǎng)24 h后，細菌顯微照片如圖2所示。

圖2 細菌顯微照片

從圖1可見，兩種培養(yǎng)基平板上均無雜菌生長，說明培養(yǎng)基滅菌徹底且葉片表面消毒完全，表明所分離到的細菌為柑橘葉片的內生細菌。

2.2 柑橘植株內生細菌的分離結果

從柑橘葉片中分離到的內生細菌經平板劃線分離結果如圖3所示，對內生細菌進行革蘭氏染色后鏡檢如圖4所示，柑橘植株內生細菌的分離鑒定結果見表1。

圖3 內生菌純化結果

圖4 內生菌革蘭氏染色鏡檢結果

從結果可知，從柑橘葉片內分離到的內生細菌均為桿狀革蘭氏陽性菌。不同品種的患黃龍病柑橘植株葉片可分離出不同種類的內生細菌，而且內生細菌在不同品種的患黃龍病柑橘植株葉片中出現(xiàn)的頻次也不盡相同，這可能是由內生細菌對不同柑橘植株的適應性的差異引起的。

表1柑橘植株內生細菌的分離鑒定結果

2.3 柑橘內生細菌DNA提取結果

柑橘內生細菌DNA提取的電泳結果如圖5所示。

圖5 柑橘內生細菌DNA的提取結果

成功將柑橘內生細菌的DNA提取出來，2號點樣空有白色亮斑出現(xiàn)，說明可能含有RNA和蛋白質等雜質存在，說明此方法提取內生細菌的DNA可能含有多糖和酚類物質，這些物質可能會對PCR檢測結果造成影響，導致出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。

2.4 柑橘內生細菌16S rDNA的PCR檢測

柑橘內生細菌16S rDNA的PCR檢測的電泳結果如圖6所示。

圖6 柑橘內生細菌16S rDNA的PCR檢測結果

柑橘內生細菌16S rDNA經過PCR技術成功擴增出條帶，但由于柑橘內生細菌16S rDNA在提取時濃度不高，條帶較不清晰。且經過多次平行PCR測試證明，柑橘內生細菌16S rDNA均能擴增出條帶，且PCR擴增效率較穩(wěn)定，擴增片段送至上海生物工程公司測序，經過BLAST比對和內生細菌多樣性分子鑒定結果可知，分離出的4種內生細菌均為芽孢桿菌屬，且感染柑橘植株內生細菌種類與無癥柑橘植株的種類存在明顯的差異。

3 結論

內生細菌在植物體內普遍存在，其種類和數(shù)量常與植物生長年限及其所處的環(huán)境因素有一定的關系，而且本研究由于采樣數(shù)量和采樣地點有限，因此所分離的內生細菌的種類受到了一定的限制。采用常規(guī)方法獲得的優(yōu)勢屬為芽孢桿菌。且因實驗時間較長，因采集樣品的季節(jié)不同，得到的菌種有所不同。除了個例，目前還沒有成功分離培養(yǎng)柑橘黃龍病病原菌的報道。

柑橘黃龍病對我國柑橘產業(yè)造成的經濟損失不可估量，所以分離純化出柑橘黃龍病病原菌的拮抗內生菌，對拯救我國乃至世界柑橘產業(yè)來說急不可待。

[1]鄧烈,周常勇.世界柑橘產銷現(xiàn)狀與趨勢[J].柑桔與亞熱帶果樹信息,2005,21(1):1-4.

[2]Bové J M.Huanglongbing: a Destructive,Newly-emerging,Centuryold Disease of Citrus[J].Journal of Plant Pathology,2006,88(1):7-37.

[3]羅永蘭,張志元,喻珺.柑橘內生細菌的分離與鑒定[J].湖北農業(yè)科學,2006,45(6):773-775.

[4]梁盛年,李充璧.肇慶地區(qū)柑橘內生細菌的分離及初步鑒定[J].安徽農業(yè)科學,2014,42(35):12510-12512.

[5]劉小勇,田素忠,秦國夫,等.提取植物和微生物DNA的SDSCTAB改進法[J].北京林業(yè)大學學報,1997,19(3):100-103.