某規(guī)?；i場豬藍耳病的診斷控制及其病原分子學研究

陳 雷

福州大北農生物技術有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種高度接觸性傳染病，又稱豬藍耳病[1]。該病以繁殖障礙、呼吸道疾病、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為妊娠母豬的流產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各階段豬的呼吸道癥狀[2-3]。該病于1987年首先在美國發(fā)現(xiàn)，隨后于1988年和1990年在加拿大和德國發(fā)生。1991年在荷蘭暴發(fā)PRRS，并迅速蔓延。中國臺灣于1991年發(fā)現(xiàn)該病，中國大陸于1996年發(fā)現(xiàn)該病，并成功分離到北美型毒株，2006年初，我國南方豬群中暴發(fā)以發(fā)病急、傳播快、高發(fā)病率和病死率等為特征的高致病性藍耳病，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了難以估量的損失[4]。2015年又出現(xiàn)新型變異株[5]。目前，PRRS在世界范圍內流行，給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失，嚴重阻礙了國際間生豬及其豬產品的貿易，已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要疫病之一。

目前疫苗免疫仍然是該病的主要防控手段，但不同廠家的疫苗其免疫結果大相徑庭，筆者根據(jù)浙江某規(guī)?；i場豬群生產成績、豬藍耳病的發(fā)病情況，并結合實驗室檢測結果及毒株的分子生物學信息，探討當前該豬場豬藍耳病的流行特點及疫苗免疫與流行株之間保護力的關系，以期為豬藍耳病的有效防控提供臨床指導。

1 材料方法

1.1 豬場選擇及豬場背景 藍定抗使用5年生產成績穩(wěn)定的規(guī)模化豬場為浙江金華市某豬場，存欄母豬480頭，2012年使用福州大北農生物技術有限公司藍定抗至今，生產成績較為穩(wěn)定。其中2015年豬場暴發(fā)流行性腹瀉，損失仔豬近487頭。

該場的免疫疫苗有：豬瘟疫苗、偽狂犬疫苗、圓環(huán)疫苗、支原體疫苗、口蹄疫疫苗和藍耳疫苗。豬場的生產成績如下（見表1）。

1.2 試驗材料 解剖亞健康保育豬4頭，采集脾臟、淋巴結、肺臟和其他病變組織，并送實驗室檢測。

1.3 試驗方法 以提取的樣品cDNA為模板，利用聚合酶鏈式反應方法（RT-PCR）對豬藍耳病病毒進行擴增。根據(jù)GenBank中GP5基因片段，在其保守區(qū)設計特異性引物對陽性樣品進行RT-PCR擴增，擴增產物送至上海立菲生物技術有限公司進行測序。

表1 豬場2011-2016年生產成績

1.4 GP5基因生物信息學分析 用DNAstar軟件對陽性樣品GP5基因進行核苷酸同源性分析，通過MEGA6.0構建進化樹，分析其遺傳進化關系。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測結果 檢測結果顯示：送檢的4份病料中有3份為陽性。對陽性樣品 （暫命名為ZJ-01株）進行GP5基因擴增，擴增出大小約600 bp的目的條帶（見圖1）。

2.2 GP5基因生物信息學分析 遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，構建的進化樹分為兩大基因型：GenotypeⅠ,GenotypeⅡ。GenotypeⅡ分為5個亞群：以VR2332為代表株的Ⅰ亞群；以CH-1a為代表株的Ⅱ亞群；以HP-PRRSV為代表的Ⅲ亞群；以NADC30為代表株的Ⅳ亞群；以GM2重組株為代表株的Ⅴ亞群。ZJ-01株與ZJ1503株親緣關系較近，核苷酸同源性達93.7%；與QYYZ株、CM2株屬于同一進化分支，親緣關系較近，同位于Ⅴ亞群（見圖2-圖3）。

圖1 GP5基因RT-PCR檢測結果

3 討 論

1）GP5基因核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，ZJ-01株與ZJ1503株親緣關系較近，同源性達93.7%。遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，該流行株與QYYZ株、CM2株屬于同一進化分支，親緣關系較近。其中QYYZ株、CM2株同來源于中國流行株與進口的經典疫苗株MLV的重組株。此外，該毒株與類NADC30株、經典株、變異株的核苷酸同源性均不是很高，達85%左右，推測該毒株極有可能是經典株與流行株的新重組株。

圖2 ZJ-01株GP5基因核苷酸同源性分析

圖3 ZJ-01株GP5基因遺傳進化分析

2）這一結論與中國農業(yè)科學院報道出現(xiàn)的豬藍耳病病毒的自然重組毒株結果相符合。2006年起，中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物病原監(jiān)測與分子流行病學創(chuàng)新團隊對我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行病學開展了持續(xù)大量的監(jiān)測工作，發(fā)現(xiàn)了輸入性的北美毒株與本地流行株發(fā)生自然重組現(xiàn)象。2015年，Zhao等[4]報道了具有高致病性的毒株JL580，指出該毒株為NADC30與Hp-PRRSV的重組株。Li等[6]報道了HNyc15為VR2332與CH-1a的重組病毒株。張洪亮等[7]對15株類NADC30株PRRSV進行重組分析發(fā)現(xiàn)，除LNCH160407株外，其余14株均存在重組現(xiàn)象。PRRSV的重組現(xiàn)象已經成為大家關注的焦點之一，探討PRRSV重組株的有效防控方案迫在眉睫。

3）通過對豬場2011年保育豬成活率只有50%、免疫藍定抗后豬群處于穩(wěn)定狀態(tài)、臨床使用效果以及對ZJ-01株GP5基因的生物信息學分析，推測豬場自然重組毒株（ZJ-01株）的致病性既沒有高致病性藍耳病那樣有很大的危害，也沒經典毒株那么溫和，其致病性介于兩者之間，所以，一定要引起足夠重視。免疫藍定抗弱毒活疫苗后，該豬場一直很穩(wěn)定，由此說明藍定抗對該自然重組毒株有很好的交叉免疫保護。

[1]Park C H,Hwi W S,Kang Ikjae,et al.A new modified live porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine improvesgrowth performance in pigsunder filed conditions[J].Clinical and Vaccine immunology,2014,21(9):1350-1356.

[2]郭寶清,陳章水,劉文興,等.從疑似PRRS流產胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病,1996,18(2):1-4.

[3]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRSin China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLoS One,2007,2(6):e526.

[4]Zhao K,Ye C,Chang X B,et al.Importation and recombination are responsible for the latest emergence of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virusin China[J].JVirol,2015,89(20):10712-10716.

[5]高志強,郭鑫,楊漢春,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒缺失變異株的基因組特征[J].畜牧獸醫(yī)學報,2005,36(6):578-584.

[6]Li Y Y,Ji G B,Wang J,et al.Complete genome sequence of an NADC30-Like porcine reproductive and respiratory syndrome virus characterized by recombination with other strains[J].Genome Announc,2016,4(3):330-336.

[7]張洪亮,張晶,李真,等.2016年我國部分地區(qū)類NADC30新亞群豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異分析 [J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(9):676-680.