棕櫚酰四肽-7的固相合成

李乾，張忠旗，郭添，王萬科，楊小琳，趙金禮

（陜西慧康生物科技有限責(zé)任公司，陜西西安 710054）

棕櫚酰四肽-7（Palmitoyl Tetrapeptide-7）又稱為棕櫚酰四肽-3，其氨基酸序列為Pal-Gly-Gln-Pro-Arg，縮寫為Pal-GQPR，屬于信號(hào)類勝肽中棕櫚酰寡肽系列多肽中的一種。

傳統(tǒng)化妝品中的功能性原料主要由無機(jī)化學(xué)合成或植物萃取提取，而近些年來，化妝品中的主要成分逐漸發(fā)展為生物基因技術(shù)產(chǎn)物[1]。20世紀(jì)90年代左右，以天然膠原蛋白質(zhì)為主的化妝品一度備受追捧，但事實(shí)上人皮膚所具有的生理化學(xué)屏障尤其是角質(zhì)層會(huì)將這些高分子的成分阻擋在外，基本無法透過表皮發(fā)揮進(jìn)一步的作用，讓這一類成分淪為炒作的概念。后來又引入了蛋白質(zhì)碎片概念，指將蛋白質(zhì)通過水解和發(fā)酵等辦法分解為大量雜短肽，而由于這類多肽片段和肽序無法針對(duì)選擇，成分不單一，因此僅可用于一般保濕和修復(fù)。這類多肽混合物并不是嚴(yán)格意義的美容勝肽[2]。

真正意義的美容勝肽需同時(shí)具備以下特點(diǎn)：（1）特定的氨基酸序列和分子量，目前常見美容勝肽為2～10個(gè)氨基酸縮合物；（2）機(jī)理清晰，明確作用于皮膚某個(gè)微觀受體；（3）添加量少；（3）來源大都為化學(xué)合成。這類小分子寡肽，具有無毒、高生物活性、特定的生化生理機(jī)制、同源性且易吸收的特點(diǎn)，從本質(zhì)上解決各類皮膚問題，而備受化妝品行業(yè)的關(guān)注。棕櫚酰系列多肽更是其中的佼佼者。

棕櫚酰系列多肽屬于信號(hào)類勝肽，能夠促進(jìn)基質(zhì)蛋白（matrix protein）尤其是膠原蛋白的合成，同時(shí)還可能促進(jìn)彈性蛋白、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖和纖維連接蛋白等多種蛋白的生成。棕櫚酰肽通過增加基質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)來促進(jìn)膠原蛋白的合成，增加皮膚彈性和更顯年輕。類似傳統(tǒng)的抗皺原料，如維生素C、維生素A的衍生物，但促進(jìn)膠原蛋白生成的能力遠(yuǎn)勝于維生素C和維生素A視黃醇。

目前，國際上關(guān)于棕櫚酰五肽-3和棕櫚酰三肽-1的合成方案較多，而棕櫚酰四肽-7的寥寥無幾。本文主要介紹一種固相多肽合成棕櫚酰四肽-7的方法，選用Fmoc作為氨基酸的氨基保護(hù)基，將目的肽的第一個(gè)氨基的羧基固體載體二氯樹脂（2-CTC Resin）相連，以形成產(chǎn)物Fmoc-Arg(pbf)-2-CTC Resin為多肽合成的起點(diǎn)，在載體樹脂上使要合成的多肽進(jìn)行逐個(gè)延伸縮合接肽反應(yīng)，最終合成肽鏈，將其酸解脫去樹脂可得到目標(biāo)產(chǎn)物的粗品，然后再對(duì)粗品進(jìn)行鑒定和純化可得到最終產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 主要的原料和試劑

Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、棕櫚酰氯、DIC、HoBt、HBTU、2-CTC Resin，均購自吉爾生化上海有限公司；DMF、DCM、異丙醇、甲醇，均為分析純，購自西安浩業(yè)化工有限公司；DIEA、哌啶、乙酸酐，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

超聲波清洗器(昆山市儀器有限公司KQ-500B）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司 SHB-Ⅲ)、電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司 SE6001F）、制備高效液相色譜儀（創(chuàng)新通恒LC3000）、分析高效液相色譜儀(日立全自動(dòng)L2000系列）、C18分析色譜柱（大連物理化學(xué)研究所4.6mm×250mm）、弱陰離子交換柱（自填體積為150mL 保賽生物科技公司填料粒徑為45～165 μm的DEAE高流速瓊脂糖微球）、C18制備色譜柱（成都科譜生物有限公司，50mm×450mm）。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）樹脂活化。將10 g 2-CTC-Resin樹脂（Lot No：GRAS1014-1，Cross-linking：1%DVB，Particle Size：100 ～ 200 mesh，Substitution 1.75 mmol/g）加入反應(yīng)器中，加入80mL DCM，室溫?cái)嚢杞?0 min使其充分溶脹活化。

（2）合成Fmoc-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。在步驟（1）的樹脂中加入12.49 g Fmoc-Arg(pbf)-OH、12mL DIEA、100mL DCM，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，其中2-CTC Resin、Fmoc-Arg(pbf)-OH、DIEA的摩爾比為1∶1.1∶4，用90mL異丙醇和90mL DMF各進(jìn)行洗滌兩次，得到保護(hù)肽樹脂。

（3）將步驟（2）樹脂肽中加入100mL 20%哌啶的DMF溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20 min。抽濾去除溶液，再次加入100mL 20%哌啶的DMF溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10 min，除掉2-CTC Resin上的9-芴甲氧羰基基團(tuán)。用100mL異丙醇和100mL DMF各洗滌兩次。

（4）合成Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。在步驟（3）的樹脂中加入Fmoc-Pro-OH（11.8 g）、HOBT （7.09 g）、DIC（8.2mL）、DMF（90mL），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，其中2-CTC-Resin、Fmoc-Pro-OH、HOBT 、DIC的摩爾比為1∶2∶3∶3，用90mL異丙醇和100mL DMF各進(jìn)行洗滌兩次，得到保護(hù)肽樹脂。

（5）合成Gly-Gln(trt)-Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。重復(fù)步驟（3）和（4），依次連接Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Gly-Gln(trt)-Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。

（6）合成Pal-Gly-Gln(trt)-Pro-Arg(pbf)-2-CTC Resin肽樹脂。將步驟（4）中的樹脂中加入10.7mL棕櫚酰氯、7.24mL DIEA、120mL DCM，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20 min。其中2-CTC Resin、棕櫚酰氯、DIEA的摩爾比為1∶2∶2.5，用120mL異丙醇和120mL DMF各洗滌兩次，甲醇洗滌三次，干燥得24 g樹脂肽。

（7）制備棕櫚酰四肽-7配制肽樹脂切割液。將三異丙基硅烷、三氟乙酸、苯甲硫醚、水按體積比為5∶4∶88∶3加入到燒杯內(nèi)攪拌混合。

（8）切割肽樹脂。在步驟（6）肽樹脂中加入200mL切割液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，過濾，濾液在38℃濃縮至油狀物，傾倒到冷凍的400mL無水乙醚中，滴加1.5mL濃鹽酸，大量白色固體析出，攪拌，離心、分離出上清液，室溫減壓烘干，得棕櫚酰四肽-7粗品，經(jīng)反相色譜法純化、濃縮、凍干得到棕櫚酰四肽-7純品11.75 g，純度＞95%。

2 結(jié)果討論

2.1 優(yōu)化條件下合成棕櫚酰四肽-7結(jié)果

棕櫚酰四肽-7最終產(chǎn)品HPLC分析圖譜如圖1所示。由圖中可以看出，純度＞98%，得到純品11.75 g，產(chǎn)率95.91%。

2.2 固相合成與液相合成棕櫚酰四肽-7比較

傳統(tǒng)液相法在合成多肽物質(zhì)時(shí)有極大的局限性。相比于固相合成，液相法對(duì)于二肽和三肽的合成具有很明顯的成本優(yōu)勢(shì)，但隨著肽鏈的加長，液相法的操作難度及耗費(fèi)時(shí)長均成倍增加，同時(shí)所得產(chǎn)物產(chǎn)率及純度也下降明顯。就本文所述棕櫚酰四肽-7使用常規(guī)液相合成方案進(jìn)行合成，其合成周期長達(dá)3周，而固相法只需要三天；同時(shí)，固相法所得產(chǎn)物產(chǎn)量、純度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液相法，且液相法合成方案操作復(fù)雜程度遠(yuǎn)高于固相合成。

圖1 棕櫚酰四肽-7最終產(chǎn)品HPLC分析圖譜

2.3 縮合劑用量對(duì)棕櫚酰四肽-7合成的影響

本文介紹的固相法合成棕櫚酰四肽-7方法采用的是HOBT+DIC的縮合體系。其中DIC作為主要的縮合劑，其量越大反應(yīng)速率越快，根據(jù)實(shí)驗(yàn)表明，最低量不得低于樹脂2.5倍的摩爾質(zhì)量，同時(shí)考慮反應(yīng)放熱，為防止高溫使多肽變性，DIC量不宜過大。由于DIC縮合易產(chǎn)生消旋作用，因此HOBT作為防消旋劑其添加量應(yīng)與DIC摩爾數(shù)相同。

3 結(jié)論

本文介紹了一種固相法合成棕櫚酰四肽-7的方法，具有操作簡單快捷，副產(chǎn)物少，易于分離純化，可重復(fù)性高的特點(diǎn)。相較于液相合成方案，縮短合成時(shí)間，合成步驟少，節(jié)省試劑用量，極大的減少了生產(chǎn)成本，同時(shí)為日后大規(guī)模生產(chǎn)提供了成熟有效的合成方案。

[1]李校坤,姚成燦,黃亞東,等.生物活性多肽護(hù)膚品的基礎(chǔ)及應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè),2002,32(5):41-43.

[2]鐘星,郭建維,成秋桂.勝肽在化妝品中的應(yīng)用和最新進(jìn)展[J].日用化學(xué)工業(yè),2012,35(11):35-36.