利用專家系統(tǒng)評估多菌靈殺菌劑的安全性

劉超，林文鋒，程樹軍

（廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623）

植物保護劑的廣泛使用帶來了嚴重的農(nóng)藥殘留問題，農(nóng)藥的健康風險和環(huán)境風險評估，不僅要考慮農(nóng)藥殘留物本身，還要考慮包括環(huán)境生物中的代謝、降解及反應產(chǎn)物，如哺乳動物、禽類、家畜、植物內的代謝物數(shù)據(jù)和環(huán)境歸宿（包括土壤、水/沉積物中的微生物降解）數(shù)據(jù)以及毒性數(shù)據(jù)，這些信息需要大量的試驗支持?？紤]到動物福利和成本效益等因素，充分利用包括計算機模型和體外測試在內的替代方法是一條可行的途徑。一些模擬新陳代謝的計算機方法，如基于知識的毒性定性預測系統(tǒng)（Derek）、基于結構參數(shù)集的優(yōu)化方法（OASIS TIMES）和化學物質生物活性預測（PASS）等，已陸續(xù)應用于化學物質及其代謝產(chǎn)物毒性的預測[1]。本文以多菌靈為例，用2種計算機專家系統(tǒng)預測微生物和哺乳動物新陳代謝產(chǎn)生的潛在代謝物，用于健康危害評估[2-4]。

1 多菌靈殺菌劑模擬

1.1 多菌靈殺菌劑的特點

多菌靈是甲基苯并咪唑-2-氨基甲酸酯或2-（苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯（IUPAC）的通用名稱，它是一種使用范圍廣的內吸性殺菌劑，屬于高選擇性苯并咪唑類化合物，主要用于收割前后或者儲存植物的病害防治，能有效抵制多種子囊菌、擔子菌類和半知菌類。歐盟2006/135/EC第一次把多菌靈列入批準使用的植物保護劑指令附件Ⅰ內。歐洲食品安全局（EFSA）重新對多菌靈進行了評估。EFSA審查了多個數(shù)據(jù)的變化差距，其中包括紫外光譜、溶解度、電離常數(shù)、土壤中的好氧生物降解途徑等方面的評估。為了探索用代謝模擬工具來填補數(shù)據(jù)差距的可能性，有人用化學反應活性和化學歸宿軟件工具CRAFT Explorer v1.0模擬了多菌靈的生物降解途徑，預測其有多種潛在代謝物。對于多菌靈的哺乳動物代謝已有大量文獻報道，利用這些數(shù)據(jù)，可對現(xiàn)有的預測工具（如Meteor 12.0.0和OECD QSAR應用工具箱2.0）中關于代謝模擬的適用性進行評估。

苯并咪唑殺菌劑的作用方式主要依靠徹底親和真菌微管（β微管蛋白亞單位）破壞其增殖過程，如有絲分裂紡錘體的形成、核分裂、細胞骨架形成。對于不同的有機體，苯并咪唑殺菌劑的選擇性毒性及其相對效力有很大不同，主要取決于化學品本身，及所作用的微管蛋白的結構和親和作用。但是苯并咪唑的也會對其他真核細胞產(chǎn)生毒性作用，例如引起植物染色體畸變、改變葉綠體的光合作用、影響萌芽和幼苗生長、破壞其他生理過程，改變植物細胞代謝，導致植物形態(tài)發(fā)生變化。苯并咪唑殺菌劑會被土壤有機質集中吸附，被非目標植物吸收導致對作物產(chǎn)生有害影響。

此外，苯并咪唑殺菌劑對于哺乳動物的毒性也備受關注，因為多菌靈不僅作為母體“活性”成分，而且還是苯菌靈[1-（正丁胺基甲酰）苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯]和甲基硫菌靈的代謝產(chǎn)物。哺乳動物毒性試驗表明，多菌靈具有一些毒性特點，如對皮膚、眼睛無刺激性，可引起皮膚致敏，大鼠的短期毒性試驗表明可導致肝重量增加、睪丸重量減輕、無精子癥和體重減輕等。由于對有絲分裂紡錘體蛋白干擾的原因，多菌靈可導致（體內和體外的）染色體數(shù)目畸變，但是不會導致基因突變或者染色體畸變。大鼠和兔的經(jīng)口發(fā)育毒性試驗證明多菌靈是一種發(fā)育毒劑和致畸劑?；谏鲜鲅芯浚嗑`的分類標識為致突變原Cat.2（R46）和生殖Cat.2（R60-61），同時提議其為R43（與皮膚接觸可能會導致過敏）。

在代謝物的毒性方面，多菌靈乙酸可代謝為2-AB（氨基苯并咪唑），研究表明后者急性毒性比母體更劇烈，而短期毒性相同。多菌靈可能是來自苯菌靈殺菌劑的代謝產(chǎn)物，通過分裂正丁胺基甲酰母體側鏈產(chǎn)生。它可由甲基硫菌靈形成，通過硫脲基甲酸酯分裂，硫分裂然后環(huán)化形成咪唑部分。多菌靈的毒性與相關前體的毒性相比時，得出以下結論：（1）與苯菌靈相比，多菌靈的急性毒性與之相同，短期毒性和長期毒性都更高，生殖、發(fā)育毒性相同；（2）與甲基硫菌靈相比，多菌靈的急性和長期毒性相同，短期、生殖和發(fā)育毒性更高[5]。

1.2 用CRAFT模擬多菌靈的生物代謝

1.2.1 CRAFT法和模型設置

為了填補科學數(shù)據(jù)的不足，使用CRAFT Explorer v1.0軟件進行多菌靈生物降解途徑的模擬。該軟件由分子網(wǎng)絡股份有限公司開發(fā)，源自明尼蘇達大學生物催化和生物降解數(shù)據(jù)庫（UM-BBD）的各種不同環(huán)境反應類型的知識庫。簡單來講，為了預測多菌靈的化學反應性和歸宿，應把多菌靈參與的一系列降解反應及其可能得到的產(chǎn)物集中在一起，構建模擬降解途徑作為基礎，然后用CRAFT Explorer生成所有從多菌靈開始一直到代謝終點之間一切能想到的反應，最終生成三個預測的變量：（1）一個適用于估算的概率模型；（2）取消進一步降解時的標準；（3）概率閾值。

CRAFT Explorer概率模型由幾個反應規(guī)律、反應類型和分配給各個規(guī)律的概率種類構成。反應類型是對化學轉化的一般定義，提供反應形式并注明必要的子結構特性和轉化定義。反應規(guī)律執(zhí)行某個反應類型，把一般定義與具體的反應條件和似然估計聯(lián)系起來。軟件中提供了兩個可用的概率模型，即UM-BBD概率模型和酯水解樣品模型。

UM-BBD概率模型是一種生物轉化規(guī)律模型，用于評定生物降解反應規(guī)律時，充分考慮了氧氣、土壤（濕度適中）或者水體、pH值（中性）、溫度（25℃）、無競爭性或者有其他有毒的化合物這些反應條件。在模擬生物降解樹圖中，用下列分配給每個反應規(guī)律的模型種類估算規(guī)定條件下每種已確認的反應類型的可能性：（1）極有可能發(fā)生的反應，即肯定發(fā)生、最優(yōu)先發(fā)生的反應；（2）很可能發(fā)生的反應，即幾乎所有微生物都能催化，并與存在于分子里的功能團發(fā)生特定反應時使用；（3）中性，適用于那些常見的，但在每個模擬系統(tǒng)中并不一定會發(fā)生的反應。例如，由于每個基質的原因，有些極可能發(fā)生的反應可能會，也可能不會發(fā)生，這需要逐案調查。

根據(jù)UM-BBD概率模型預測，得到多菌靈生物降解模型的概率閾值設置如下：0～0.2表示不會發(fā)生的反應（紅色）；0.3～0.4表示不太可能發(fā)生的反應（橙色）；0.5～0.6表示可能發(fā)生的反應（黃色表示0.5，淺綠色表示0.6）；0.7～0.8表示很可能發(fā)生的反應（綠色）；0.9～1.0表示極有可能發(fā)生的反應（深綠色）。

接下來是運行CRAFT Explorer模擬程序，前提是要知道發(fā)生的反應量、生成的產(chǎn)物量以及生物降解的步驟數(shù)量，如生物降解層數(shù)，在模擬程序運行時，軟件會把這些因素都考慮在內。假如降解步驟增加，所要確認的產(chǎn)物的數(shù)量也相應增多，因為要重復提交所有分子（如在各個降解層生成的產(chǎn)物）。為了有效運行多菌靈生物降解模擬程序，應選擇步驟的最大數(shù)（如5）使模擬運行最為徹底。最終生物降解模擬前的最后一步是選擇總概率閾值。根據(jù)CRAFT Explorer的解釋，反應產(chǎn)物的總概率可以定義為降解樹圖中之前所有產(chǎn)物中產(chǎn)生其中一種產(chǎn)物的概率，如圖1所示選擇總概率閾值可以讓CRAFT生成不太可能產(chǎn)生的產(chǎn)物減少。閾值越大，軟件要確定的產(chǎn)物越少。假如閾值設置為0.6，則CRAFT Explorer沒有生成總概率值小于0.6的產(chǎn)物。

圖1 CRAFT總概率閾值的定義

1.2.2 多菌靈生物降解樹圖

圖2的生物降解樹圖直觀地說明了多菌靈及其代謝物的整個過程，包括產(chǎn)生每個已確定的降解產(chǎn)物的所有降解路線。多菌靈的生物降解途徑由17個降解步驟構成，產(chǎn)生15種不同的降解產(chǎn)物（P2～P16），即從P2[2-氨基苯并咪唑（2-AB）]到P16[1氫-苯并咪唑-2-基氨基甲酸酯（2-氨基甲酸苯并咪唑）][3]。由于產(chǎn)生的所有代謝物與特定的反應類型和特定的UM-BBD反應規(guī)律有關，所以CRAFT確認這兩種情況一共產(chǎn)生了7種反應類型?？傮w上看，發(fā)生頻率最高的反應類型是UM-BBD bt0005（鄰-未取代的芳香化合物，鄰-二羥基芳族）和UM-BBD bt0367（鄰-未取代的芳香化合物，鄰-雙氫二羥基芳族），兩者反應類型都與鄰-未取代的芳香化合物的雙加氧反應以及之后的氧化反應有關，導致鄰苯二酚衍生物形成，每種類型都導致不同降解層有4種不同降解產(chǎn)物形成。其他反應規(guī)律還包括bt0003（醛羧酸酯）、bt0023（二脂族醚乙醇+醛）、bt0065（1-氨基酸-2-未取代的芳香化合物、鄰-二羥基芳族+胺）、bt0318（氨基甲酰胺+碳酸鹽）、bt0384（單烷基碳酸鹽，烷基-醇）。

圖2 CRAFT Explorer1.0模擬的多菌靈生物降解樹圖

1.3 用Meteor模擬多菌靈的哺乳動物代謝

1.3.1 Meteor法和模型

多菌靈殺菌劑的哺乳動物代謝模擬采用Lhasa公司開發(fā)的Metero v12.0.0軟件。其原理是根據(jù)建立、儲存于知識庫里的新陳代謝方面的專業(yè)知識規(guī)范進行模擬。根據(jù)Metero知識庫的生物轉化規(guī)則和推理規(guī)則對多菌靈分子結構進行處理，預測與哺乳動物有關的代謝產(chǎn)物，生成代謝物的數(shù)量限制在400以內，任何給定的途徑中最多生成步驟只有四步，生成多菌靈生物轉化過程由三步構成：

（1）根據(jù)多菌靈的分子結構搜索知識庫查找生物轉化，生成一份潛在代謝物清單；

（2）根據(jù)絕對推理規(guī)則排除生成的代謝物，絕對推理規(guī)則是以文獻中觀察到的發(fā)生率和產(chǎn)出率、基質的物理化學性質（Log P和分子重量）、基質是否是查詢結構、是否是Meteror生成的代謝物等因素為基礎，從而用指定的概率水平選擇代謝物，編制一份更短的代謝物清單。Meteor中與預測的生物轉化和代謝物有關的不確定術語包括：“可能”（至少有一個有力的正面論據(jù)，并且沒有反對的論據(jù)）、“似乎可能”（有力的證據(jù)支持）、“模棱兩可”（支持和反對的證據(jù)力度相同）、“可疑”（有力證據(jù)反對該假設）和“不可能”（至少有一個有力的反對論據(jù)證明該假設是錯誤的，且沒有正面論據(jù)）；

（3）根據(jù)相關推理規(guī)則，通過對比競爭生物轉化以及確定哪個有優(yōu)先轉化權來排除更多代謝物。相關推理規(guī)則只包括最可能的（即“1級”）生物轉化作用。

在完成Meteor分析后，以代謝樹圖的形式把與查詢結構相匹配的知識庫生物轉化過程形象地表現(xiàn)出來。

1.3.2 多菌靈代謝樹圖

用Meter12.0.0模擬多菌靈代謝樹圖的結果如圖3所示，從位于頂部的查詢結構（Q）開始，其后是第一代代謝物（M1—M3），其次是它們在各自母體下面的更多代的代謝物（M4）。該軟件除了可以提供多靈菌生物轉化作用的整個途徑外，還可以提供轉化的概率水平信息。

圖3 由Meteor 12.0.0模擬的多菌靈代謝樹圖

Meteor12.0.0可以識別多菌靈在哺乳動物體內的兩種一期生物轉化反應，即水解氨基甲酸酯和羥基化稠苯反應，以及一種二期生物轉化反應，即醛糖酸化芳香族醇反應。每個生物轉化反應由知識庫參考號和參考名進行識別。

水解氨基甲酸酯和羥基化稠苯反應被認為是可能發(fā)生在哺乳動物體內的反應，預測由兩種一期反應產(chǎn)生的代謝物M1、M2、M3的概率為“似乎可能”，其主要根據(jù)是多菌靈的親脂特性。非親脂性的反應相關的概率只能是“可疑”。Meteor還提供了一種篩選特殊生物轉化反應中間體的附加選項，如多菌靈在氨基甲酸酯水解反應中形成的兩種中間體，即異氰酸鹽和氨基甲酸，由于其預期的親電性高，所以異氰酸鹽屬于“可能加合形成的”中間體。另外，由于氨基甲酸脫羧基作用極為快迅速，不會聚集或著很難發(fā)現(xiàn)，所以它被稱為“認定的”中間體（Meteor種類-ap）。對于稠苯化合物的羥基化反應，代謝物的過程中，應用說明2（3）位置比1（4）位置更可能發(fā)生反應的關于氮的補充推理規(guī)則。對于二期生物轉化，Meteor12.0.0可以確定芳香族醇醛糖酸化反應類型。其發(fā)生概率完全只取決于基團的親脂性，由于基團M3的親脂性為中性，所以估計反應為“似乎可能”，因為基團親脂性高，則醛糖酸化反應被認為是“可能”的反應，基質親脂性低，則被認為是“模棱兩可的”反應。另外，芳香族醇（苯酚和芳雜環(huán)類似物）硫酸化反應被認為是醛糖酸化反應的競爭反應，但是最終發(fā)生該反應的可能性更低。上述多菌靈的結構及所有生成的一期和二期生物轉化代謝物的詳細見表1。

表1 由Meteor12.0.0 生成的多菌靈代謝物（警示結構標為紅色）

2 結果與討論

2.1 多菌靈的生物降解

根據(jù)文獻綜合分析，多菌靈在裸土里被分解時，其半反應期為6～12個月，草皮里的半反應期為3～6個月，有氧和無氧條件下，在水中的半反應期分別為2個月和25個月。主要的微生物代謝產(chǎn)物是2-氨基苯并咪唑（2-AB），然后2-AB被進一步生物降解。

本文用CRAFT軟件預測了多菌靈的P3、P4、P5、P6和所有“二醇”衍生物，其中預測2-AB主要代謝產(chǎn)物，并確認了很多理論上會產(chǎn)生的產(chǎn)物（見表1）。這些預測結果有助于對該物質進行風險評估，了解其主要生物降解路線及產(chǎn)物，便于確定進一步的研究方向。但不能把預測結果直接用于填補目前的數(shù)據(jù)空白，也不能用于決策。因為，用于監(jiān)管目的還應考慮更充足的信息，例如：模擬工具的局限性，證據(jù)是否充分和足夠（例如：可能有某些降解物/代謝物產(chǎn)生的部分證據(jù)），如何用（預測的）毒理學資料補充代謝物信息（例如用QSAR預測工具）等。

2.2 多菌靈的哺乳動物代謝

目前，關于多菌靈哺乳動物代謝途徑的文獻比較多，包括用大鼠、小鼠、兔、狗、羊和牛的代謝研究。研究表明多菌靈生物轉化的基本途徑與羥基化作用有著密切聯(lián)系，其主要代謝物為氨基甲酸甲酯5-羥基苯并咪唑-2-基（5-HBC），次要產(chǎn)物是氨基甲酸甲酯5，6-二羥苯并咪唑-2-基（5，6-DHCB）。羥基化代謝物較容易形成可排泄的硫酸鹽和葡萄糖醛酸結合物。還有少量的5，6-HOBC氮氧化物。水解作用的主要代謝物是2-氨基苯并咪唑（2-AB）。

比較后發(fā)現(xiàn)，Meteor12.0.0應用工具箱預測的代謝物和實驗確認的代謝物差異并不大，主要取決于軟件使用者選定的限制條件，這對于預測的準確性非常關鍵。由于Meteor用于預測代謝途徑的概率級別為“似乎可能”，所以它只確認多菌靈羥基化作用的主要產(chǎn)物（如5-HBC），并不預測次要代謝物（5，6-DHBC）。同樣，預測葡萄苷酸化5-HBC產(chǎn)生的代謝物（5-HBC-G），而不預測競爭性硫酸化反應產(chǎn)生的副產(chǎn)物（5-HBC-S），因為該反應的概率沒有達到“似乎可能”級別。

如果用不同的Meteor初始設置來模擬多菌靈的哺乳動物代謝物，可能會得到不同的預測結果。首先，把最小概率從“似乎可能”改成“模棱兩可”并且選擇“全程”選項，則可模擬產(chǎn)生323種不同的預測代謝物，不僅有來自原始模擬確認的生物轉化（如水解氨基甲酸酯、羥基化稠環(huán)和葡萄苷酸化芳香族醇）產(chǎn)生的代謝物，還有如氮氧化芳香氮等概率為“模棱兩可”的其他反應產(chǎn)生的代謝物，預測結果會導致形成實驗確認的代謝物（如5，6-HOBC-氮氧化物）?？梢?，代謝模擬的結果完全取決于使用者指定的軟件設置值，因此必須根據(jù)調查目的仔細選擇軟件設置值。

2.3 微生物降解與哺乳動物代謝的相似之處

就微生物降解與哺乳動物代謝之間的相似之處來講，在任何情況下，水解和羥基化都是最重要的反應。所有軟件工具都能確認主要多菌靈代謝物2-氨基苯并咪唑（2-AB），它的急性毒性比母體化合物（非劇毒）高。很多母體分子或者形成的（中間體）代謝物的羥基化產(chǎn)物由三種軟件工具進行確認，而這些軟件確認的產(chǎn)物多菌靈哺乳動物代謝的實驗數(shù)據(jù)相一致。

3 結論

大多數(shù)代謝模擬工具并不僅有唯一的一組預測結果，使用者應根據(jù)調查目的，通過更改模型限制條件，模擬多種生成途徑和代謝物的可能性。CRAFT Explorer和Meteor都能根據(jù)使用者的調查目的，擴大或者縮小模擬的范圍來估算形成特定代謝物的概率。這也為使用者完善預測提供了一個合理依據(jù)。如果知道被軟件忽略的反應（由于不可能發(fā)生），使用者可以用自己掌握的知識來決定是否也要考慮遺漏的生物轉化。如果研究的目的是要確認相關的有毒代謝物，可以把代謝模擬的結果和所知道的或預計的代謝物的毒理性質一起加以考慮。得到預測結果后，還可以結合其他毒理學理論，如根據(jù)TTC法，將代謝剖析圖與母體化合物的毒理學剖析圖進行比較、評估，判定是否任何相關的有毒代謝物的TTC閾值都小于母體化合物。如果把計算機模擬、現(xiàn)場監(jiān)測和實驗室數(shù)據(jù)整合使用，可以為制定管理決策提供更豐富的預測支持[6]。

[1]程樹軍.化妝品評價替代方法標準實施指南[M].北京:中國標準出版社,2017

[2]Berglof T,Van Dung T,Kylin H & Nilsson I.Carbendazim sorptiondesorption in Vietnamese soils[J].Chemosphere,2002,48:267-273.

[3]CRAFT (Chemical Reactivity and Fate Tool) Explorer 1.0[Z].Molecular Networks GmbH,Erlangen,Germany,http://www.molecular-networks.com/.

[4]Dimitrov SD,Breton R,Macdonald D,et al.Quantitative Prediction of Biodegradability,Metabolite Distribution and Toxicity of Stable Metabolites[J].SAR and QSAR in Environmental Research,2002,13(3-4):445-455.

[5]Dimitrov SD,Kamenska VB,Walker JD,et al.Predicting the Biodegradation Products of Perfluorinated Chemicals Using CATABOL[J].SAR and QSARin Environmental Research,2004,15(1):69-82.

[6]EFSA.Applicability of QSAR analysis to the evaluation of the toxicological relevance of metabolites and degradates of pesticide active substances for dietary risk assessment[J/OL].2010,http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/scdoc/50e.htm