蘇木水提物抗蛇毒磷脂酶A2活性研究

樂貞 陳旭明 姚水洪 馮敬騫 朱曉萍 陳敏

【摘 ?要】 中藥蘇木（Sappan Lignum）來源于植物蘇木（Caesalpinia sappan L.）的干燥心材，具有止血抗炎等功效。采用瓊脂糖平板法研究不同濃度的蘇木水提物（0.03g/ml，0.06g/ml，0.09g/ml，0.12g/ml，0.15g/ml）對蛇毒sPLA2水解活性的抑制作用，測量透明圈和孔的直徑，根據(jù)酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其抑制率。結(jié)果表明0.15g/ml蘇木水提物對五步蛇毒sPLA2水解活性有抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 蘇木;五步蛇毒;抗蛇毒活性

Study on the water extract of Sappa Lignum against the activity of phospholipase A2 from Snake Venom

Le Zhen * ? Chen Xuming ? Yao Shuihong ? Feng Jingqian ? Zhu Xiaoping ? Chen Min

（QuZhou College of Technology ZheJiang ? ? 324000）

[Abstract] The traditional Chinese medicine Sappan Lignum is derived from the dry heartwood of the plant Caesalpinia sappan L. It has the effect of hemostasis and anti-inflammation. Agarose plate method was used to study the inhibitory effect of ?the water extract of ?Sappa Lignum （0.03g / ml， 0.06g / ml， 0.09 g / ml， 0.12g / ml， 0.15g / ml） on the hydrolysis activity of snake venom sPLA2. The diameter of transparent circle and pore were measured and the inhibition rate was calculated according to the standard curve of enzyme activity. The results show that the water extract of 0.15g/ml has the inhibitory activity against the hydrolysis activity of sPLA2 from the venom of Agkistrodon acutus.

[Keywords] sappan lignum; agkistrodon acutus venom; antivenom activity

毒蛇咬傷致殘致死率非常高，且每年被毒蛇咬傷案例時(shí)常發(fā)生。蛇傷患者最常見的癥狀是發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量的炎癥因子，如IL-6，TNF-α等。sPLA2是蛇毒酶中主要組分之一，sPLA2在人和動物體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的炎癥因子，進(jìn)一步激活下游的炎癥反應(yīng)[1-3]。

南美響尾蛇 sPLA2可引起膜磷脂釋放花生四烯酸，引起中毒后炎癥反應(yīng)。該sPLA2可被黃酮類化合物橡黃素（quercetin）化學(xué)修飾而失活。而且黃酮類的苯并吡喃酮環(huán)還可以與PLA2上酶活性位點(diǎn)附近的Phe5， Trp31和Phe98結(jié)合[4]。

中藥蘇木（ Sappan Lignum）為豆科云實(shí)屬（也稱為蘇木科）植物蘇木（ Caesalpinia sappan L. ） 的干燥心材， 又名蘇方木[5]。其藥理作用主要是活血祛瘀、抗腫瘤、抗氧化、消炎止痛等[6]。其特征性成分之一為高異黃酮類化合物，主要以苷元形式存在，還富含有其他黃酮類化合物，蘇木為小喬木，藥用部位為心材，這個(gè)部位常以次生代謝物苷元為主，高異黃酮類化合物可能是其主要藥效物質(zhì)[7-8]。目前國內(nèi)對于蘇木科藥用植物抗蛇毒sPLA2活性研究尚少，本文旨在研究我國境內(nèi)蘇木抗蛇毒sPLA2的活性，為從中草藥中開發(fā)抗蛇毒藥物提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 材料與試劑

中藥蘇木（上饒愛心大藥房），五步蛇蛇毒凍干粉（黃山蛇毒廠），Source 30Q陰離子交換色譜填料（GE公司），0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），低分子量蛋白質(zhì)Marker14.4kDa-97.4kDa、考馬斯亮藍(lán)G-250（北京索萊寶公司），SDS（十二烷基磺酸鈉）、Bis（甲叉雙丙烯酰胺）、Acr（聚丙烯酰胺）、Tris堿、甘氨酸、TEMED（四甲基乙二胺）、AP（過硫酸胺）（sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 蘇木水提物的制備 ?蘇木適當(dāng)粉碎后加適量雙蒸水，浸泡3小時(shí)，煮沸提取60min，收集濾液，藥渣再加水煮30min。合并二次藥液，置4℃過夜，濾清，水浴干燥。稱取干燥提取物3g、6g、9g、12g、15g分別加入100ml雙蒸水，加熱使完全溶解，分裝，高壓蒸氣滅菌供實(shí)驗(yàn)用。配制成生藥含量為0.03g/ml，0.06g/ml，0.09g/ml，0.12g/ml，0.15g/ml的蘇木藥液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蛇毒的制備 ?取五步蛇蛇毒凍干粉，用0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）為溶劑，配制成1mg/mL蛇毒樣品，置于4℃過夜溶解，次日離心1，000rpm，10min后，取上清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛇毒sPLA2的分離純化 ? 采用陰離子交換進(jìn)行純化，柱填料為Source 30Q，體積為7ml，使用流動相A（20mM Tris-Hcl ，PH8.0）平衡柱15min，2ml/min。取1.2.2制備的蛇毒樣品過柱，流速為2ml/min;流動相A繼續(xù)平衡柱，2ml/min。 使用流動相B（20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，PH8.0）以4ml/min的流速分別于10%、20%、30%、40%、60%、80%、100%階段洗脫蛋白，在A280nm監(jiān)測下收集洗脫峰。SDS凝膠檢測蛇毒sPLA2組分，運(yùn)用Quantity One軟件掃描WB膠片，以蛋白灰度值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)。

1.2.4 蛇毒sPLA2純化后各組分活性檢測 ?制備瓊脂糖平板[9]，準(zhǔn)備9cm玻璃平皿，取700μl蛋黃母液與470μl 0.01mol/L CaCl2先在平皿里混勻。將工作緩沖液重新加熱溶解，待冷卻至60℃左右加入上述混合液中，至平板1/3高度即可。用塑料管直立插入溶液進(jìn)行打孔;形成凝膠后，孔即成形，拔出塑料管，清理孔內(nèi)凝膠。取1.2.3五步蛇毒sPLA2分離純化后的各個(gè)組分80ul，加入各孔內(nèi)，蛇毒sPLA210 μl與70 μl生理鹽水混勻作為陽性對照，80ul生理鹽水作為陰性對照。37℃放置5h，觀察透明圈大小。選取水解活性最大的組分作為靶酶。

1.2.5 蛇毒sPLA2的酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線 ?制備瓊脂糖平板，將1.2.4水解活性最強(qiáng)的蛇毒sPLA2（1mg/ml），依次稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，依次取蛇毒sPLA2及稀釋后的溶液10μl與30μl的20mM Tris-HCl（PH8.0）混合，并分別加入至瓊脂糖平板的孔內(nèi)，以40μl的20mM Tris-HCl（PH8.0）作為空白對照。將平板置于37℃孵育5h，測量每組孔的透明圈直徑長度（d）。利用軟件Graph Pad 5.0分析數(shù)據(jù)，以每孔sPLA2質(zhì)量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的透明圈體積為縱坐標(biāo)，繪制五步蛇和眼鏡蛇sPLA2的酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線及得出其函數(shù)方程式。

1.2.6 抗蛇毒磷脂酶A2水解活性 ?采用瓊脂糖平板法檢測蘇木水提物對蛇毒sPLA2的抑制活性。取蛇毒sPLA210 μl與不同濃度0.03g/ml、0.06g/ml、0.09g/ml、0.12g/ml、0.15g/ml的蘇木水提物30 μl混勻，加入各孔內(nèi)，蛇毒10 μl與30 μl生理鹽水混勻作為陽性對照組，40ul生理鹽水作為陰性對照組。37℃放置5h，測量透明圈直徑大小。依據(jù)五步蛇毒sPLA2的曲線函數(shù)，計(jì)算PLIγ的抑制率。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?蛇毒sPLA2的分離純化及活性檢測

如圖1.A所示，五步蛇毒經(jīng)純化后，共收集到6個(gè)洗脫峰：F1、F2、F3、F4、F5、F6。圖1.B SDS凝膠考馬斯亮藍(lán)染色顯示，它們均含有sPLA2，運(yùn)用Quantity One軟件掃描WB膠片，以蛋白灰度值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)，F(xiàn)4含量最高。且瓊脂糖平板結(jié)果同時(shí)顯示F4活性最大（見圖1.C），因此將F4作為靶酶。

（A）五步蛇sPLA2純化，F(xiàn)1-F6分別為洗脫得到的蛇毒組份。（B）SDS凝膠檢測五步蛇sPLA2分離純化后各組分，從左至右依次是F1-F6。（C） 瓊脂糖平板檢測五步蛇sPLA2活性，F(xiàn)1-F6分別為不同濃度NaCl洗脫的蛇毒組份，F(xiàn)0為生理鹽水作為空白對照組。

2.2 ?蛇毒sPLA2的酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.5方法依次取F4（1mg/ml）及稀釋后的溶液10μl，即sPLA2質(zhì)量分別為10μg、5μg、2.5μg、1.25μg、0.625μg、0.3125μg，經(jīng)瓊脂糖平板孵育8小時(shí)后，測量得到它們的透明圈直徑長度。以每孔sPLA2質(zhì)量為橫坐標(biāo)，與它們相對應(yīng)的透明圈體積（cm3）為縱坐標(biāo)，利用軟件Graph Pad 5.0繪制五步蛇sPLA2的酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2.B），得到函數(shù)方程：

（A） 五步蛇毒sPLA2不同濃度的水解活性。0為生理鹽水陰性對照組，1-6分別為0.3125ug、0.625ug、1.25ug、2.5ug、5ug、10ugsPLA2酶水解活性。（B）五步蛇毒組份F4的sPLA2酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。（C） 五步蛇組份F4的對數(shù)與透明圈面積的線性趨勢。

2.3 ?蘇木水提物對五步蛇蛇毒sPLA2的抑制活性

Source 30Q分離純化后的蛇毒sPLA2經(jīng)Bradford法檢測，濃度為500μg /ml，其抑制五步蛇sPLA2酶活性的結(jié)果如圖3所示，陰性對照組（生理鹽水）無透明圈，實(shí)驗(yàn)組6（sPLA2+0.15g/ml蘇木水提物）的透明圈小于陽性對照組，但抑制效果不顯著。實(shí)驗(yàn)組2-5與陽性對照組無明顯差別，無抑制活性。根據(jù)透明圈直徑和五步蛇sPLA2酶活曲線的函數(shù)方程，計(jì)算得抑制率為30%。

0：40ul生理鹽水，1：10ul蛇毒sPLA2，2-6：分別為10ul蛇毒sPLA2和30ul不同濃度的蘇木水提物，其濃度依次為0.03g/ml，0.06g/ml，0.09g/ml，0.12g/ml，0.15g/ml。

3 ?討論

通過瓊脂糖平板實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)蘇木水提物對五步蛇毒sPLA2的抑制活性不顯著，或許是因?yàn)樘K木水提物成分復(fù)雜，未經(jīng)分離純化，導(dǎo)致有抑制活性的成分含量過低。此外郭春風(fēng)等[10]發(fā)現(xiàn)蘇木乙酸乙酯提取物對慢性柯薩奇病毒性心肌炎的治療作用。蘇木通過降低外周血中TNF-α水平，抑制心肌炎免疫損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。Washiyama等[11]從蘇木醇提物中分離到巴西蘇木素、蘇木查爾酮，原蘇木素 D 及原蘇木素 E 等化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)蘇木查爾酮，原蘇木素D及原蘇木素E則對NO，PGE2，TNF-α，IL-6，COX-2等均有抑制作用。可見蘇木的抗炎作用是多種成分相互作用的結(jié)果。而蘇木水提物對五步蛇毒sPLA2所表現(xiàn)出的抑制活性，是否是因?yàn)槠潼S酮類化合物與sPLA2之間的相互作用，有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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