腎康注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究

李曉春+王莉芳+徐長根

摘 要：目的 建立腎康注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法，以期能夠替代家兔熱原法控制產(chǎn)品的熱原，達到快速、高效、可靠、簡便的目的。方法 按《中國藥典2015年版四部》通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法進行試驗。采用兩個不同廠家的的鱟試劑，對7個不同批次的樣品開展干擾試驗，確定最小不干擾稀釋倍數(shù)，并對樣品進行了細菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果 供試品4倍稀釋液無干擾作用，細菌內(nèi)毒素限值定為1.0 Eu/ml。結(jié)論 用細菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原法是可行的。

關(guān)鍵詞：腎康注射液；細菌內(nèi)毒素；鱟試劑；干擾試驗

中圖分類號：R927 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.01.025

文章編號：1006-1959（2018）01-0070-04

Study on Bacterial Endotoxin Test of Shenkang Injection

LI Xiao-chun，WANG Li-fang，XU Chang-gen

（Shaanxi Province Food and Drug Inspection Institute，Xi'an 710065，Shaanxi，China）

Abstract：Objective To establish a bacterial endotoxin test for Shenkang injection in order to replace the pyrogen of rabbits' pyrogen control system and achieve the goal of rapid，high efficiency，reliability and simplicity.Methods According to the"Chinese Pharmacopoeia 2015 edition four"general rule 1143 bacterial endotoxin test method for testing.Tropsch reagents from two different manufacturers were used to perform interference tests on 7 different batches of samples to determine the smallest non-interfering dilution and bacterial endotoxin testing of the samples.Results 4-fold dilution of the test sample without interference，bacterial endotoxin limits set at 1.0 Eu/ml.Conclusion Bacterial endotoxin test instead of pyrogen method is feasible.

Key words：Shenkang injection；Bacterial endotoxin；Tropsch reagent；Interference test

腎康注射液為黃棕色澄明液體，可降逆泄?jié)?、益氣活血、通腑利濕，適用于慢性腎功能衰竭屬濕濁血瘀證[1-4]?！吨袊幍?015年版四部》通則9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中明確指出靜脈用注射劑均應(yīng)設(shè)細菌內(nèi)毒素或熱原檢查項。目前，腎康注射液現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)SFDA標(biāo)準(zhǔn)（試行）YBZ08522004中是用家兔法控制熱原的，家兔法存在試驗條件要求高、操作繁瑣、影響因素多、動物個體差異大等缺點，而細菌內(nèi)毒素檢查法具有快速靈敏、重現(xiàn)性好、簡便易行等優(yōu)點[5-8]。因此對于腎康注射液更傾向于采用細菌內(nèi)毒素檢查法?；诖?，本文通過實驗探討細菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用于腎康注射液的可行性，為提高該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 腎康注射液（規(guī)格20ml/支，批號2016010 32、201601031、201601033、201603021、201604022、01603013、201604031）；細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE，規(guī)格80 Eu/支，批號150601-201580，中國食品藥品檢定研究院）；BET水（規(guī)格5 ml/支，批號160006-201401，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑TAL[批號1507180，湛江博康海洋生物有限公司（簡稱博康海洋）；批號1507202，湛江安度斯生物有限公司（簡稱安度斯）；規(guī)格及靈敏度分別為0.1 ml、0.25 Eu/ml]。

1.2儀器選取 DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ZH-2自動渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1.3方法

1.3.1鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核 按《中國藥典2015年版四部》通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法項下規(guī)定，用BET水將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取已復(fù)溶的鱟試劑18支，其中16支分別加入0.1 ml上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行4支，另外2支加入0.1 mlBET水作陰性對照。

1.3.2細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定 《中國藥典》規(guī)定L=K/M，注射劑K=5 Eu/（kg·h），M為人用kg·h最大供試品量，參照腎康注射液用法用量，本品為靜脈滴注，1次/d 100 ml，使用10%葡萄糖液300 ml稀釋，按30滴/min計算，體重按60 kg計算，則L = 3.33 Eu/ml，最終將限值定為3 Eu/ml。

1.3.3供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定 《中國藥典》規(guī)定供試品最大稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ，國內(nèi)市售鱟試劑的λ常為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 Eu/ml，則對應(yīng)的供試品的MVD分別為6、12、24、48、96倍。endprint

1.3.4干擾試驗預(yù)實驗 用BET水將7批腎康注射液分別制成原液、2、4、6、8、12倍的系列溶液，記為供試品陰性對照（NPC）系列；制備相同倍數(shù)的供試品系列溶液，使每個溶液中都含有2 λ的內(nèi)毒素，記為供試品陽性對照（PPC）系列；同時設(shè)立陽性對照（PC）管和陰性對照（NC）管。

1.3.5正式干擾試驗 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇相應(yīng)稀釋度溶液進行正式干擾試驗。以該溶液及BET水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的系列溶液，分別取0.1 ml加至已復(fù)溶的鱟試劑管內(nèi)，每一濃度平行4支，另設(shè)2支陰性對照。

1.3.6供試品細菌內(nèi)毒素檢查 取7批腎康注射液，以其不干擾稀釋溶液，用兩個廠家TAL進行細菌內(nèi)毒素檢查，每1 ml腎康注射液中含細菌內(nèi)毒素的量不得過3 Eu。

2 結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度復(fù)核 兩批鱟試劑靈敏度測定值（λc）均在0.5 λ～2 λ之間，結(jié)果符合規(guī)定，見表1。

2.2干擾試驗預(yù)實驗 7批腎康注射液稀釋到4倍時，可排除干擾，見表2～表3。

2.3正式干擾試驗 Et/Es值均在0.5～2.0之間（Es和Et分別表示細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的BET水溶液和細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供試品溶液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值），根據(jù)《中國藥典》的評判標(biāo)準(zhǔn)，腎康注射液4倍稀釋液無干擾作用，說明使用鱟試劑法進行內(nèi)毒素檢查是可行的，見表4。

2.4供試品細菌內(nèi)毒素檢查 以腎康注射液的4倍稀釋溶液，用兩個廠家TAL進行細菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均符合規(guī)定，見表5。

3討論

熱原是指能造成恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)，有外源性和內(nèi)源性之分。細菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復(fù)合物，屬外源性致熱原。通常來講，內(nèi)毒素是熱原，但熱原不全是內(nèi)毒素。嚴格來講，并非每種熱原都具有脂多糖結(jié)構(gòu)，但所有已知的內(nèi)毒素脂多糖都有熱原活性。因此，在GMP環(huán)境中形成一個共識--不存在細菌內(nèi)毒素即不存在熱原。家兔法是通過靜脈注入家兔體內(nèi)一劑量的供試品，在規(guī)定時間內(nèi)測其體溫變化，從而判定供試品的熱原限度是否符合規(guī)定。我國于五十年代將此法載入藥典，而在六十年代末發(fā)明了鱟試劑法，即利用鱟試劑來檢測或量化內(nèi)毒素。鱟試劑法相比于家兔法，具有快捷、高靈敏度、操作簡便易重現(xiàn)等優(yōu)點，受到了現(xiàn)代藥檢的青睞。

腎康注射液屬二類新藥，主要成分有黃芪、大黃、丹參、紅花。君藥為黃芪，臣藥為大黃，黃芪健脾升清，大黃通腑降濁，一升一降，二者相輔，從而化瘀祛濁。丹參、紅花活血止痛，共為佐使[9]。腎康注射液在臨床實踐中表現(xiàn)出廣泛的預(yù)防腎損傷，保護腎功能的作用[10]，尤其在治療糖尿病腎病、慢性腎功能衰竭、老年慢性腎病方面功效卓著[11-13]。但是，腎康注射液成分復(fù)雜，容易造成一些不良反應(yīng)的發(fā)生，熱原反應(yīng)較為常見[2-3，14]。因此，對這類療效確切、應(yīng)用廣泛的中藥注射液加強熱原檢查很有必要，這對保障臨床用藥安全，嚴格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)意義深遠。

本文對腎康注射液進行了細菌內(nèi)毒素干擾試驗，結(jié)果表明，其4倍稀釋液對鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾作用，證實可建立鱟試劑法以替代家兔法控制熱原，并且本文將其限值從文獻[4]的4 Eu/ml提高到3 Eu/ml，嚴格了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為保證結(jié)果的可靠性，本文選取了兩個不同廠家的鱟試劑，消除了鱟試劑可能的反應(yīng)差異，并對7批腎康注射液進行了研究，增加了試驗的可信度。因此，本試驗為該品種在新版的國家標(biāo)準(zhǔn)中將家兔法修訂為細菌內(nèi)毒素檢查法提供了科學(xué)依據(jù)。

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收稿日期：2017-6-22；修回日期：2017-7-10

編輯/李樺endprint