生物膜中活性菌株的分離純化及抑藻活性研究

唐桂明，叢巍巍，王 科，于雪艷，張華慶，呂 釗，桂泰江

（1.大連遼南船廠，遼寧大連 116041；2.海洋涂料國家重點實驗室，海洋化工研究院有限公司，山東青島 266071）

0 引言

海洋是生命的搖籃，給人類提供了豐富的資源和能源，與人類的生活早已密不可分。但在人類開發(fā)和利用海洋資源的過程中，海洋中的污損生物［1］給航運、海水養(yǎng)殖以及海洋工程等帶來巨大的安全隱患和經(jīng)濟損失。它們的附著污損會加速船體及浸海設施的腐蝕［2］；增加船舶的航行阻力［3-4］；增大燃油消耗［5］；導致二氧化碳排放量增加和全球溫室效應加??；堵塞養(yǎng)殖網(wǎng)箱［6］以及冷卻水管道；使海洋儀器儀表失靈；影響艦艇航速以及聲納裝置的偵查性能［7］；削弱軍艦的戰(zhàn)斗力等。并且外來物種的入侵對海洋生態(tài)的破壞也是難以估量的，據(jù)世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）2014年報告中稱，世界上90%以上的生態(tài)系統(tǒng)都曾遭受過外來物種入侵，外來物種的入侵導致了全球20%脊椎動物的滅絕，每年給全球造成數(shù)千億美元的損失［8］。迄今為止，涂覆防污涂料仍然是眾多防止海洋生物附著的方法中最為經(jīng)濟和有效的措施。

傳統(tǒng)防污涂料［9］通過砷、汞、鉛等重金屬的釋放，在涂層周圍產(chǎn)生毒性環(huán)境，對污損海生物進行趨避毒殺。其釋放的重金屬在海洋中難以降解，隨著生物鏈的傳遞，在海洋生物體內(nèi)蓄積。在取得良好防污效果的同時，亦給海洋生態(tài)造成難以修復的創(chuàng)傷。為此，各國紛紛出臺相應的公約及環(huán)保法規(guī)以限制防污毒劑的使用，并要求對含防污劑的防污涂料進行海洋環(huán)境風險評估，提高了此類防污涂料的市場準入門檻?，F(xiàn)階段市場的主流技術產(chǎn)品——無錫自拋光防污涂料，以氧化亞銅［10］作為主防污劑，其含量高達30%～50%，據(jù)統(tǒng)計，每年約有幾百萬升以銅類防污劑為主的防污毒料釋放到海洋中，它們會在海洋，特別是海港中大量積聚，影響海生物呼吸并致其死亡，從而破壞生態(tài)環(huán)境。因此環(huán)境友好型防污劑的開發(fā)和使用凸顯其重要性。近年來，從天然產(chǎn)物［11］中提取次級代謝物等活性物質(zhì)作為有毒防污劑的替代產(chǎn)品的探索一直沒有停止腳步。本研究以青島海域生物膜中分離純化的活性菌株作為受試菌株，考察其對藻類的抑制附著行為，為環(huán)境友好型防污劑的研發(fā)提供基礎指導。

1 試驗儀器及材料

1.1 試驗儀器

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；GXZ-3100型光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；SIGMA離心機，德國；CASY快速細胞活力分析儀，德國Innovatis公司。

1.2 試劑

氯化鈉（NaCl），分析純，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心；氯化鉀（KCl），分析純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4），分析純，天津廣成化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4），分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗生物

海洋微藻中肋骨條藻（Skeletonema costatum）：硅藻門、中心綱、圓篩藻目、骨條藻科、骨條藻屬。中肋骨條藻是一種廣溫廣鹽的海洋浮游硅藻，它廣泛分布于世界各大洋的近海海域，對近岸海域初級生產(chǎn)力以及海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要作用［12］。中肋骨條藻是我國沿海近岸海域浮游植物常見優(yōu)勢種類［13］，其赤潮也頻繁發(fā)生。因此本研究將其作為試驗生物。

1.4 活性菌株

通過對防污涂料樣板表面生物膜進行分離純化，共獲得6種活性菌株，如表1所示。

表1 篩選活性菌株Table 1 Choice of active strains

2 CASY緩沖溶液的配制

分別稱取8.00 g NaCl、0.20 g KCl、3.58 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶解于1 L蒸餾水中，待完全溶解后，采用0.22 μm醋酸纖維膜對緩沖溶液進行過濾，得到CASY緩沖溶液，并將其置于4～25℃下保存［14］。

3 試驗方法

3.1 f/2營養(yǎng)液的制備及上清液的獲得

先對試驗所用錐形瓶、容量瓶等玻璃儀器進行酸處理，再用蒸餾水將其沖洗干凈后，進行高壓滅菌（120℃，0.2 MPa，20 min）。試驗過程中所用海水經(jīng)0.45 μm醋酸纖維膜過濾后，再進行高壓滅菌（120℃，0.2 MPa，20 min），待冷卻后，配制成f/2營養(yǎng)液。

將培養(yǎng)好的6種細菌發(fā)酵液分別裝入50 mL離心管中，于8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，離心靜置后收集上清液。

3.2 抑藻試驗［15］

將長勢良好的中肋骨條藻藻種接種到5 L玻璃容器中，容器中含有4 L f/2營養(yǎng)液海水，置于光照培養(yǎng)箱中進行擴大化培養(yǎng)，其中培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強度為4 000 Lx，明暗周期為12 h∶12 h。在藻細胞處于指數(shù)生長期時，將藻液以相同體積（100 mL）轉(zhuǎn)移到已經(jīng)滅菌處理過的250 mL錐形瓶中，將6種細菌發(fā)酵液及離心得到的上清液按不同體積加入到上述藻液中，達到各設置的梯度濃度，見表2，每個梯度濃度設置3個平行樣。搖勻后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時取樣，用CASY快速細胞活力分析儀測定藻種的密度。

表2 抑藻試驗發(fā)酵液梯度濃度設置Table 2 The determined concentration of fermentation broth for algae inhibition test

4 試驗結(jié)果

試驗過程中分別制備了6種細菌發(fā)酵液以及上清液，考察其對中肋骨條藻的生長抑制作用，結(jié)果見圖1。由圖1可見，Exiguobacterium indicum發(fā)酵液（圖1a）濃度低于3%時，對中肋骨條藻生長產(chǎn)生促進作用；濃度為4%時，前90 h處于促進藻生長狀態(tài)，90 h時達到最大值后開始抑制生長；濃度為5%時，始終處于抑制中肋骨條藻生長的狀態(tài)。Exiguobacterium indicum上清液（圖1b）在濃度為2%的前70 h內(nèi)，對中肋骨條藻生長的促進以及抑制作用不是很明顯，但在70 h之后，對其生長產(chǎn)生明顯的抑制作用；而濃度高于2%時，均處于抑制藻類生長的狀態(tài)。

圖1 6種細菌發(fā)酵液及上清液對中肋骨條藻的生長抑制作用Figure 1 Inhibition to Skeletonema costatum of the fermentation broth and supernatants of six active strains

Exiguobacterium acetylicum發(fā)酵液（圖1c）濃度低于3%時，促進中肋骨條藻的生長；濃度為4%且35 h內(nèi)抑制中肋骨條藻的生長，之后又促進了藻的生長；而濃度高于5%時抑制藻的生長；Exiguobacterium acetylicum上清液（圖1d）在濃度2%時的前50 h促進藻生長到最大值后開始抑制藻生長；濃度高于2%時均處于抑制中肋骨條藻生長階段。

Bacillus cereus發(fā)酵液（圖1e）在濃度低于2%時，促進中肋骨條藻生長；濃度為3%和4%時，開始促進藻生長到最大值后開始抑制藻生長；濃度高于5%時，抑制藻生長；Bacillus cereus上清液（圖1f）濃度為2%時，開始促進藻生長之后抑制其生長；濃度高于3%時，抑制藻生長。

Pseudoalteromonas發(fā)酵液（圖1g）濃度低于2%時，促進中肋骨條藻的生長；濃度為3%和4%時，開始促進藻生長之后抑制藻生長；濃度高于5%時，抑制藻生長。Pseudoalteromonas上清液（圖1h）濃度在2%時，先促進藻生長到最大值后抑制藻生長；濃度高于3%時，始終處于抑制藻生長的狀態(tài)。

Kytococcus sedentarius發(fā)酵液（圖1i）濃度在2%時，促進中肋骨條藻生長；濃度為3%～4%時先促進生長再抑制生長；濃度高于5%時，抑制藻生長。Kytococcus sedentarius上清液（圖1j）濃度在2%時，先促進生長后抑制生長；濃度高于3%時，抑制藻生長。

Aureobasidium pullulans HN發(fā)酵液（圖1k）濃度為0.5%時，促進中肋骨條藻生長；當其濃度高于1%時，抑制藻生長；Aureobasidium pullulans HN上清液（圖1l）濃度低于0.5%時，促進藻生長；當濃度高于1%時，抑制藻生長。

對試驗結(jié)果計算EC50值，結(jié)果如表3所示。由表3可見，活性菌株發(fā)酵液對中肋骨條藻的抑制作用要稍弱于其上清液，6種細菌對中肋骨條藻表現(xiàn)出的抑制作用大小為：Aureobasidium pullulans HN最強；其次為Bacillus cereus和Pseudoalteromonas；而Kytococcus sedentarius、Exiguobacterium indicum和Exiguobacterium acetylicum抑制作用相差不大。由表3還可知，微生物發(fā)酵液的毒性物質(zhì)主要存在于離心后的上清液中。

5 結(jié)語

采用防污漆樣板表面獲得的6種活性菌株的發(fā)酵液及上清液對中肋骨條藻進行藻類生長影響的試驗研究。研究結(jié)果表明，活性菌株上清液對中肋骨條藻有更好的抑制作用，其抑制作用大小為：Aureobasidium pullulans HN最強；其次為Bacillus cereus和Pseudoalteromonas；而Exiguobacterium indicum、Exiguobacterium acetylicum和Kytococcus sedentarius的抑制作用相差不大，且發(fā)酵液對藻類生長的影響結(jié)果與上清液類似。微生物發(fā)酵液的活性抑藻物質(zhì)更多地存在于離心后的上清液中。由于活性抑藻物質(zhì)來源于海洋活性菌株，從而為環(huán)境友好型防污劑的獲得提供了理論基礎。

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